基因工程-2-工具酶

第二章基因工程的工具酶第一节限制性内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶第四节逆转录酶第五节DNA修饰酶第一节限制性内切酶一、寄主控制的限制与修饰现象二、II型限制性内切酶的特性三、II型限制性内切酶切割类型四、II型限制性内切酶重要概念五、限制内切酶的命名

第一节限制性内切酶定义:能够识别和切割双链DNA(dsDNA)分子内特异核苷酸顺序的核酸内切酶,叫做限制性核酸内切酶.主要特征I型II型III型切割位点距寄主特异性位点至少数百bp的部位可能随机的切割位于寄住特异性位点或两侧距寄住特异性位点3’端24-26bp处序列特异的切割不是是是三种类型核酸内切酶特性差异GAATTCCTTAAG5’

3’3’

5’限制作用修饰作用GAATTCCTTAAG5’AATTCCTTAA5’

G3’3’G5’

3’3’

5’3’

5’5’

3’＋EcoRIMEcoRIMeMe核酸内切限制酶EcoRI及其修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用

EcoRI识别序列经MEcoRI甲基化之后，就再不能被EcoRI所切割一、寄主控制的限制与修饰现象限制和修饰的作用保护自身的DNA不受限制破坏外源DNA使之迅速降解一般识别和切割4和6个核苷酸顺序,少数为5、7个核苷酸,也有识别8个核苷酸的,但无4个以下的:

Sau3A

BamHⅠ5’……G-A-T-C-A-G-G-A-T-C-C……3’3’……C-T-A-G-T-C-C-T-A-G-G……5’44=25646=409648=65536二、II型限制性内切酶的特性4个6个λDNA49Kb12位点。BglII6个；BamHI5个；SalI2个。三、II型限制性内切酶切割类型1、平齐末端（Bluntend）HindII切割反应SmaI切割反应2.1产生5’粘性末端

5’-GA-A-T-T-C-3’

3’C-T-T-A-A-G-5’5’-G-3’5’-A-A-T-T-C-3’

3’-C-T-T-A-A-5’3’-G-5’2.2产生3’粘性末端

5’-C-T-G-C-A-G-3’

3’-GA-C-G-T-C-5’5’-C-T-G-C-A-3’5’-G-3’

3’-G-5’3’-A-C-G-T-C-5’EcoRI＋＋PstI2、粘性末端（Stickyend）1、同裂酶指来源不同但识别相同序列且切割位点相同。HindIII和HsuI2、同位酶

识别相同的序列但切割位点不一样。

C-C-C-G-G-GG-G-G-C-C-CA-A-G-C-T-TT-T-C-G-A-AC-C-C-G-G-GG-G-G-C-C-CC-C-C-G-G-GG-G-G-C-C-CSmaIXmaI四、II型限制性内切酶重要概念3、同尾酶

这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。G-G-A-T-C-CC-C-T-A-G-GBamHIT-G-A-T-C-AA-C-T-A-G-TBclIA-G-A-T-C-TT-C-T-A-G-ABglIIG-A-T-CC-T-A-GSau3AIU-G-A-T-C-YY-C-T-A-G-UXhoIIU表示嘌呤（A或G）Y表示嘧啶（T或C）5‘-G-A-T-C3’--3‘C-T-A-G-5’+4、酶的星号活性

当酶切条件改变时，酶的专一性可能会降低，以至于同一种酶可识别和切割多个的位点。低盐（50mM）、高pH（>8）、高甘油浓度EcoRI*EcoRIG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GG-A-A-T-T-AC-T-T-A-A-TA-A-A-T-T-CT-T-T-A-A-GG-A-G-T-T-CC-T-C-A-A-G5、双酶切方法同步双酶切分步双酶切1、命名三原则取属名第一个大写字母,种名前两个小写字母取变种、品系第一个字母构成限制酶的名称在同种生物中发现几种酶,按先后顺序用罗马字母Ⅰ、Ⅱ…HaemophilusinfluenzaedIII属名种名株型HindⅢBacillusamyloliquefaciensH淀粉液化芽胞杆菌EscherichiacoliR质粒大肠杆菌

五、限制内切酶的命名流感嗜血菌BamHⅠEcoRⅠDNA1μl(1μg)buffer(10×)2μlddH2O16μl限制性内切酶1μl(1u)总体积20μlA）确定酶切DNA的量B）计算完全酶切所需的酶量。C）10X反应液的体积应为终体积的1/10D）依次加入计算好的DNA量、10X反应液、酶。六、限制内切酶的反应体系1.底物DNA1.1DNA纯度:

1.1.1RNA与E结合影响有效酶浓度；1.1.2提取时混入杂质可改变识别特异性。1.2DNA浓度:

[DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

七、影响限制性核酸内切酶反应的因素2.识别位点及邻近位点特异性序列XmaⅢ切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。3.DNA二级/三级结构

如：超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需酶多酶切1ugλDNA，需要1-2单位的酶;酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。

4.反应系统因素（1）缓冲液（无菌、无污染）（2）金属离子（3）牛血清蛋白(BSA)

（4)温度与反应时间1.DNA重组

2.构建载体

3.DNA顺序分析

4.遗传病诊断八、限制内切酶的应用

/rebase/rebase.html第二节DNA连接酶

定义：能够催化双链分子中相邻的3’-OH和5’-P末端之间形成磷酸二酯键,使DNA分子连接起来的酶.一、种类

1.1T4-DNA连接酶—从T4噬菌体感染的大肠杆菌提取1.2大肠杆菌DNA连接酶二、DNA连接酶的连接范围

1.粘性末端DNA连接2.缺口的填补3.平末端DNA连接5’3’3’5’5’3’3’5’PPOHOH5’3’3’5’POHRNADNA5’3’3’5’OHOHPP5’3’3’5’5’3’3’5’Mg2+,ATPMg2+,ATPMg2+,ATPT4-DNA连接酶T4-DNA连接酶T4-DNA连接酶T4-DNA连接酶各种催化反应活性三、DNA连接酶的连接条件

1.双链DNA分子2.具有3’-OH和5’-P3.缺口处不缺核苷酸缺失核苷酸的裂口丢失磷酸二酯键的缺口3’5’连接酶封闭缺口连接酶无法封闭缺口无活性（a）（b）四、DNA连接酶的连接反应机制：3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’产生一个磷酸二酯键Amp酶-Amp酶T4连接酶ATPppiAmp与P反应OHP①T4DNA连接酶与ATP形成酶-Amp复合物PPA②酶-Amp复合物再结合到具5’-P和3’-OH切口的DNA上，使DNA腺苷化

③产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封闭起来，完成连接作用。PPPPPPPPPPP五、T4DNA连接酶的反应条件10×T4DNALigaseBuffer2.5μl

DNA片段*约0.3pmol

载体DNA**约0.03pmol

T4DNALigase1μlddH2Oupto25μl

反应温度16度，连接过夜。*DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3～10倍。指在DNA模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3’-OH末端聚合DNA链的一类酶。

一、种类聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA损伤修复，在半保留复制中起辅助的作用

聚合酶Ⅱ（polⅡ），在修复损伤中有重要的作用聚合酶Ⅲ（polⅢ），DNA复制过程中起主要作用

聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。第三节DNA聚合酶二、DNA聚合酶的特点：

1.需模板DNA；2.需