生物化学课件：第四章 第五节 蛋白质的重要性质

第五节蛋白质的重要性质五.蛋白质的重要性质一、胶体性质蛋白质的分子量1万~100万之间，其分子直径1~100nm之间，在胶体颗粒的范围。所以蛋白质具有胶体性质，如布朗运动、光散射、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。二、两性解离及等电点

蛋白质的等电点（pI）：当某蛋白质在一定的pH的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向z正极也不向负极移动，此时溶液的pH值叫做该蛋白质的等电点。蛋白质的带电性质与溶液的pH有关。五.蛋白质的重要性质

pH<pI

正电荷

pH>pI

负电荷

pH=pI

静电荷为零二、两性解离及等电点

五.蛋白质的重要性质蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性作用（denaturation）。1、蛋白质变性的概念2、蛋白质变性的因素物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等；化学因素：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢剂、重金属盐等；三、蛋白质的变性五.蛋白质的重要性质变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀三、蛋白质的变性生物活性丧失（酶）；溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）；基团位置改变；对蛋白酶敏感性增大。3、蛋白质变性后的表现五.蛋白质的重要性质三、蛋白质的变性4、蛋白的复性

蛋白质的变性作用若不过于剧烈，则是一种可逆过程。高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性(renaturation)。

大多蛋白质变性后，很难复性。五.蛋白质的重要性质四、蛋白质的沉淀加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质的胶体溶液就不在稳定并将产生沉淀。能使蛋白质沉淀的试剂有：1）高浓度中性盐（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白质的电荷）这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分离制备。2）有机溶剂

丙酮、乙醇(破坏蛋白质水膜)五.蛋白质的重要性质四、蛋白质的沉淀3）重金属盐

Hg2+、Ag+、Pb+

（与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐）4）生物碱试剂苦味酸、三氯乙酸、目酸、钨酸等（与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）五.蛋白质的重要性质蛋白质的分离纯化

按照蛋白质分子大小进行，能否分离取决于透析袋截留的分子量。六.蛋白质的分离和纯化1、透析(dialysis)和超滤(ultra-filtration)

透析：

透析液浓缩的蛋白样品

透析袋

开始透析处于平衡状态六.蛋白质的分离和纯化1、透析(dialysis)和超滤(ultra-filtration)

搅拌式超滤器可配备不同截留分子量的超滤膜使用，在高流速操作中对高达10%大溶质浓度的样品进行快速浓缩或脱盐，浓缩倍数可达100倍，独特的磁力搅拌设计可避免浓缩过程中的蛋白样品在膜表面形成的蛋白凝胶极化，从而加快工作速度，提高浓缩倍数。实验室用超滤器超滤2、盐析（saltingout）基本原理：不同蛋白质的不同溶解度作用机理：中性盐中和表面电荷，破坏水化层常用方法：分级沉淀法操作方法：固体加入法饱和溶液加入法六.蛋白质的分离和纯化

3、电泳(electrophoresis)：（1）带电颗粒在电场作用下向其电荷相反方向移动的现象（2）主要分成两大类：自由界面电泳

区带电泳纸、薄膜电泳3、电泳(electrophoresis)SDS在蛋白质溶解液中加入SDS和疏基乙醇。巯基乙醇使蛋白质分子中二硫键还原，使多肽分成亚基SDS使蛋白质的氢键、疏水键打开，引起蛋白质构象的改变，并形成近似长椭圆棒复合物。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴则与蛋白质的Mr成正比。2023/10/9南京农业大学生命科学学院222023/10/9南京农业大学生命科学学院23等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。5.06.07.0稳定pH梯度通电5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度pH3pH10IEFSDS双向电泳示意图4、层析

(chromatography)

根据的蛋白质性质（1）凝胶层析（过滤）：分子量与分子形状特性（2）离子交换层析：电荷特性（3）亲和层析：生物学特性

凝胶层析（GelChromatography）名称又称凝胶过滤（GelFiltration）

分子筛过滤（层析）二凝胶种类1葡聚糖凝胶（如SephadexG-100）2聚丙烯酰胺凝胶如Bio-GelP-2003琼脂糖凝胶如Sephrose4B蠕动泵层析柱缓冲液储存器自动部分收集仪紫外检测仪记录仪层析方向

凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠离子交换层析（IonexchangeChromatography）

基本概念1什么是离子交换层析？

是以离子交换剂为固定相，液体为流动相，通常是先设法让样液中的离子与离子交换剂上的解离基团进行交换而被固定在离子交换剂上，然后再通过提高溶液中相反离子浓度或者降低蛋白质所带电荷数的方法将所要蛋白质分离出来的一种层析法。离子交换剂（1）基本构成：基质功能基团反离子（2）需要满足的要求高度的不溶解性有疏松的多孔结构或有巨大的表面积有较多的交换基团有稳定的理化性质常用和重要的有：a羧甲基纤维素（CM-C）

阳离子交换剂

纤维素上交联了-O-CH2-COO-

b二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-C）

阴离子交换剂

纤维素上交联了--O-（CH2）2-NH+-（C2H5）2还有交联葡聚糖离子交换剂交联琼脂糖离子交换剂等蠕动泵层析柱梯度混合仪自动部分收集仪紫外检测仪记录仪层析方向

基本设备装置与凝胶层析相似二

基本原理5、离心（centrifugation）（1）实验室常用离心机类型

普通离心机

一般不带冷冻设备分地面式（3000-6000rpm）和台式（3000-16000rpm）

高速冷冻离心机有制冷设备台式与地面式，18000-25000rpm，0-4℃。超速离心机有制冷设备和真空设备只有地面式，达30000rpm，0-4℃。

相对离心力相对于地球引力的离心力

F（通常指单位离心力）

RCF=——=1.119x10-5rn2

（g）

mg

密度梯度（区带）离心

(densitygradient

ultracentrifugation)根据性质：分子大小、形状

蛋白质分子在具有密度梯度的介质中离心，质量与密度大的蛋白质分子比质量与密度小的沉降速度快，最后每种蛋白质分子会停留在与其自身密度相等的介质中形成区带。蛋白质含量测定和纯度鉴定（1）蛋白质含量测定在实验课中学习

微量凯氏定氮法