帕金森病患者外周血单核细胞分泌il-6和nf的临床研究

帕金森病患者外周血单核细胞分泌il-6和nf的临床研究

根据选择性黑质胺神经退行性病变的特征性病理改变，尚不清楚帕金森病的病因和发病机制，但据越来越多的数据，细胞因子作为免疫活性细胞产生的调节细胞功能的炎症介质参与了这一过程。其中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)在帕金森病患者黑质多巴胺神经元周围浓度增高,与帕金森病有密切的相关性。甲磺酸培高利特是一种对多巴胺D1和D2受体均有活性的多巴胺受体激动剂,同时认为其有神经保护作用,在体和离体情况下,也有一定的免疫调节功能。因此,我们设想培高利特对帕金森病患者的神经保护作用可能是通过调节一定的细胞因子的分泌来实现的。为证明这一观点,我们于2001年5月至2002年5月进行了本项研究。对象和方法一、分组患者的一般资料及健康对照情况选择帕金森病临床确诊的帕金森病患者17例,诊断符合Calne制定的诊断标准,且Hoehn-Yahr分级Ⅱ～Ⅳ级,根据服药情况分为2组,即培高利特+美多芭组和美多芭组,2组患者在实验开始前已持续服药1个月以上,没有服用其他抗帕金森病药物。健康对照组排除神经系统疾患。3组需排除其他系统严重疾患和感染性疾患,且年龄均≥60岁。根据以上标准入组患者及健康对照者共25例,分别为:培高利特+美多芭组8例,男6例,女2例,平均年龄(72.3±5.1)岁;美多芭组9例,男7例,女2例,平均年龄(71.2±4.9)岁;对照组8例,男6例,女2例,平均年龄(71.1±3.9)岁。3组间年龄、性别差异无显著性(P>0.05)。二、细胞活力检测于上午8∶00时左右空腹取抗凝肘静脉血4ml,加2倍量Hank’s液悬浮细胞,将此悬液加在淋巴细胞分离液(FicollHypaque,比重1.0770)上,收集血浆与淋巴细胞分离液交界的外周血单核细胞(PBMC),将细胞悬浮于含5%小牛血清的RPMI-1640培养液中计数细胞,同时用1%台盼蓝染色检测细胞活力,活细胞数>95%,再用同样培养液将细胞配成4×106/ml。分单纯RPMI-1640、加刀豆蛋白A[ConA(含ConA10μg/ml的RPMI-1640)]或加培高利特(含培高利特200pg/ml的RPMI-1640)3种不同培养基培养。各培养基中加入100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素,分别置于37℃、5%CO2孵育箱内,一定湿度下孵育42h。分别取细胞培养上清液于2ml离心管内,放置在-80℃冰箱冷冻保存待测。用比利时BioSourceEuropeS.A.公司KAC1751TNF-α试剂盒和法国DIACLONE公司IL-6ELSIA试剂盒进行ELISA,采用美国BioRad公司550型酶标仪比色测定。三、t.不同培养方法之间的t检验所有数据用SPSS10.0软件进行处理,同一样本的不同培养方法之间作配对的t检验。不同样本相同培养方法之间作组间t检验,P>0.05为无显著意义,P≤0.05为有显著意义。结果一、3il-6活性见表1。对照组ConA刺激后IL-6浓度较单纯1640培养IL-6浓度显著增高(P<0.05),而培高利特+美多芭组和美多芭组在增加ConA或培高利特刺激后IL-6浓度较前无显著变化。ConA刺激下,IL-6分泌水平培高利特+美多芭组和美多芭组均显著低于对照组(P<0.05,P<0.01),同时培高利特+美多芭组IL-6浓度显著高于美多芭组(P<0.05)。培高利特刺激下,培高利特+美多芭组、美多芭组和对照组IL-6水平,差异无显著意义(均为P>0.05)。二、3tnf-检测见表1。培高利特+美多芭组ConA刺激下TNF-α浓度较单纯1640培养和培高利特刺激均显著增高(均为P<0.01)。美多芭组ConA刺激下TNF-α浓度较单纯1640培养显著增高(P<0.05)。3种培养基培养后,TNF-α分泌水平培高利特+美多芭组、美多芭组和对照组3组间比较差异均无显著性(均为P>0.05)。早期感染克氏原螯虾生长和免疫机制以往的研究证实,参与帕金森病进程的细胞因子种类很多,其中在神经系统IL-6是由星形胶质细胞和小胶质细胞产生的,具有促进神经元修复和再生的功能,且IL-6的分泌存在较明确的中枢和外周调节机制。而TNF-α在帕金森病患者淋巴细胞和中枢神经系统中均有其特殊受体。依此,研究药物对帕金森病患者PBMC分泌IL-6和TNF-α的影响,一定程度上可以反映药物在中枢的免疫机制,了解药物可能的中枢作用机制。本研究结果显示,加入ConA刺激后,美多芭组分泌IL-6浓度有所下降,与对照组比较呈非常显著性降低,提示帕金森病可能存在PBMC分泌能力降低的免疫缺陷。Hasegawa等认为这些缺陷与其他中枢神经疾病不同,可能具有一定的疾病特异性,帕金森病中枢神经系统的改变诱导了外周免疫功能的变化。与美多芭组不同,加入ConA刺激培养后,尽管培高利特+美多芭组IL-6分泌未达到对照组水平,但较美多芭组IL-6的浓度却显著增加,提示增加培高利特治疗可以部分改善PBMC分泌IL-6的能力,免疫机制在培高利特治疗疾病的过程中可能起一定作用。IL-6分泌的改善,有利于调节神经元变性后的修复与再生,提示培高利特可能具有细胞因子介导的神经保护作用。资料显示,TNF-α在帕金森病患者黑质纹状体区和脑脊液中浓度增高,TNF-α受体在帕金森病患者黑质区的胶质细胞和多巴胺能神经元上具有免疫活性,帕金森病外周血T淋巴细胞TNF-α受体也有明显增加。Dobbs等的研究结果证实,有姿势障碍的帕金森病患者外周血清中TNF-α浓度明显增高。本研究中,在ConA刺激下两患者组PBMC分泌TNF-α能力,与单纯RPMI-1640培养时比较,明显提高了,而两组间无显著性差异。此结果提示:药物治疗的帕金森病患者PBMC体外分泌TNF-α对有丝分裂原的敏感性增加,增加培高利特治疗对TNF-α分泌无明显影响。观察培高利特体外刺激培养的PBMC分泌TNF-α的浓度,3组之间TNF-α分泌差异无显著性,提示培高利特在离体条件下对帕金森病患者PBMC分泌TNF-α也无显著影响。TNF-α具有诱导和促进帕金森病患者多巴胺神经元变性的细胞毒作用,而IL-6有利于神经元变性后的修复与再生,Muller等和Wilfried等发现