第九章吸光光度法汇总

章序名称第九章吸光光度法周次第15周至第16周授学时间11月14日至11月28日教学目的要求1.理解朗伯－比尔定律的数学体现式及意义；2.掌握摩尔吸光系数的意义和计算；3.理解选择显色剂的原理及及影响显色反映的因素；4.初步掌握分光光度法的基本原理应用；5.掌握光度法的基本原理，理解光度分析条件的控制，分光光度法的应用范畴。教学重点1、办法特点：光的性质和选择性的吸取。2、吸光光度法的基本原理：朗伯比尔分离定律；偏离比尔定律的因素。4、分光光度计的构造及应用。5、显色反映及影响因素。6、光度测量误差及条件的选择。7、吸光光度法的应用。教学难点1．吸光光度法的基本原理：朗伯比尔分离定律；偏离比尔定律的因素。2.光度测量误差及条件的选择。教学场合环境教室授课方式课堂讲授（√）；实验（）；实践（）；双语（）学时分派8学时教学方法讲授、讨论教学手段网络教学（）；多媒体（√）教学用具电子投影仪教学内容提要备注§9-1光的性质和物质对光的吸取光的性质物质对光的吸取§9-2光吸取的基本规律朗伯-比尔定律偏离朗伯-比尔定律的因素§9-3分光光度计的构造分光光度计的重要部件分光光度计§9-4显色反映及其影响因素显色反映和显色剂影响显色反映的因素三元配合物显色体系§9-5广度测量误差及其测量条件的选择仪器测量误差测量条件的选择§9-6分光光度法的应用多组分的同时测定差示分光光度计酸和碱离解常数的测定溶液中配合物构成的测定日程及课时分配节序内容学时第九章吸光光度分析法8学时第一节光的性质和物质对光的吸取1第二节光吸取的基本规律1第三节分光光度计的构造1第四节显色反映及其影响因素1第五节广度测量误差及其测量条件的选择2第六节分光光度法的应用第七节第节习题课2第节第节第节第节第节复习思考题1．有50.0mL含Cd2+5.0μg的溶液,用10.0mL二苯硫腙-氯仿溶液萃取(萃取率≈100%)后,在波长为518nm处,用1cm比色皿测量得T=44.5%。求吸取系数a、摩尔吸取系数κ和桑德尔敏捷度S各为多少?2.钢样0.500g溶解后在容量瓶中配成100mL溶液。分取20.00mL该试液于50mL容量瓶中,将其中的Mn2+氧化成MnO4-后,稀释定容。然后在λ=525nm处,用b=2cm的比色皿测得A=0.60。已κ525=2.3×103L·mol-1·3．某一光度计的读数误差为0.005,当测量的透射比分别为9.5%及90%时,计算浓度测量的相对误差各为多少?讨论练习1．与化学分析法相比,吸光光度法的重要特点是什么?2．简述朗伯-比尔定律成立的前提条件及物理意义,写出其数学体现式。3．吸取光谱曲线和原则曲线的实际意义是什么?如何绘制这两种曲线?4．为了提高测量成果的精确度,应当从哪些方面选择或控制光度测量的条件?5．简述用摩尔比法测定络合物络合比的原理。拓展学习吸光光度法的应用中学习络合物构成和酸碱解离常数的测定:络合物构成：摩尔比法、等摩尔持续变化法。酸碱解离常数：PKa=PH+lgA-AB-课程作业P.301，15，17，P.302，18，19，21，24，25P.303，28，29.完毕方式书面版（√）电子版（）提交时间课程结束交必读书目1.武汉大学化学系编，仪器分析，北京：高等教育出版社，.2.朱明华编，仪器分析，北京：高等教育出版社，1994.学生学习质量监控与评价从完毕作业状况看，本章内容部分掌握较好，有少数学生对光度计算掌握的不够好。教学后记本章内容是仪器分析的基础，打好基础很重要，在授课中突出吸光光度法的基本原理，朗伯比尔分离定律的学习；吸光光度条件的选择，可配合实验课加深学生的理解和掌握。第九章吸光光度法本章介绍的吸光光度法是一种仪器分析办法(其中目视比色法不必用仪器)。一种办法能用来进行物质的定量分析，测量的物理量与被测组分的浓度之间必须存在拟定的定量的关系。这是定量测量办法的理论基础。另首先，还需要考虑仪器设备的设计和测试条件的选择，以确保办法符合定量基本关系式，并确保有较高的精确度和可操作性。运用光信号测定物质含量的办法诸多，基于物质对光含有选择吸取的特性而建立起来的分析办法，称为吸光光度法。根据产生光吸取的质点不同，又可分为分子吸取光谱法和原子吸取光谱法。本章中讨论的紫外-可见吸光光度法是分子吸取光谱法的一种。9.1概述9.1.1光是一种电磁波，按照波长(或频率)排列，可得到电磁波谱图：光含有波粒二象性，一定波长的光含有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低。含有相似能量(相似波长)的光为单色光，由不同能量(不同波长)的光组合在一起的称为复合光。若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补光，这种现象称为光的互补。白光是复合光，让一束白光通过分光元件，它将分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等多个颜色的光。即可见光谱。9.1.2当光照射到物质上时，会产生反射、散射、吸取或透射现象，若被照射的物质为溶液，光的散射能够无视。当一束白光照射某一有色溶液时，某些波长的光被溶液吸取，另某些波长的光则透过，溶液的颜色由透射光的波长所决定。吸取光与透射光互为补色光。如硫酸铜溶液吸取白光中的黄色光而呈现蓝色；高锰酸钾溶液吸取黄绿色的光而呈紫红色。分子、原子和离子，都含有不持续的量子化能级，在普通状况下分子处在最低能态(基态)。当入射光照射物质时，分子会选择性地吸取了某些波长的光，由基态跃迁到激发态(较高能级)，其能级差E激发态－E基态与选择性吸取的光子能量h的关系为： h=E激发态－E基态分子运动涉及分子的转动、分子的振动和电子的运动。分子转动、振动能级间隔普通不大于1ev，其光谱处在红外和远红外区。电子能级间的能量差普通为1～20ev，由电子能级跃迁而产生的吸取光谱位于紫外及可见光区，其实验办法为比色法和可见、紫外吸光光度法。9.1.31.定性分析基础吸取光谱取决于分子的构造，以及分子轨道上电子的性质，不同的物质含有不同的吸取光谱，因此，吸取光谱可提供定性分析的信息。2.定量分析基础对同一物质而言，浓度不同，对特定波长光的吸取强度不同，因此，吸取强度可提供定量分析的信息。从不同浓度的高锰酸钾溶液的吸取光谱图可知，在波长535nm处的吸光强度与浓度间存在定量的关系，可由此进行定量分析。9.1.4吸取定律1.朗伯—比尔定律一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，一部分被吸取，一部分透过介质，一部分被器皿的表面反射。设入射光强度为I0'，吸取光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir。则在吸光光度法中，普通将试液和空白溶液分别置于同样材质及同样厚度的吸取皿中，因此反射光的强度基本相似，其影响能够互相抵消，故能够无视反射光的影响，可得到下式：。即光强为I0的入射光通过试液皿后，一部分光被吸取，一部分光被透射。It与I0之比称为透光率或透光度T，T=It/I0 吸光物质对光的吸取程度，还惯用吸光度A表达： A=-lgT=lg(I0/It) 实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度c和液层厚度b的乘积成正比，此即朗伯—比尔（Lambert—Beer）定律，其数学体现式为： 2.摩尔吸取系数和桑德尔敏捷度当溶液浓度以mol/L为单位时，液层厚度以cm为单位时，K惯用替代，称为摩尔吸取系数，其单位为L.mol-1.cm-1。此时朗伯-比尔定律可写为： A=bc 摩尔吸取系数是吸光物质在给定波长和溶剂下的特性常数，数值上等于1mol/L吸光物质溶液和液层厚度为1cm时溶液的吸光度，它表达吸光物质对指定频率的光子的吸取本领。越大，表达该物质对某波长光的吸取能力越强，该测定办法的敏捷度也就越高。普通认为，<104，则办法的敏捷度较低；在104~5104时，办法的敏捷度为中档；在5104~105时，敏捷度高；>105，属超高敏捷度。还可用桑德尔敏捷度（敏捷度指数）S表达办法的敏捷度，Sandell对S的定义是：在一定的波长下，测得的吸光度A=0.001时，1cm2截面积内所含的吸光物质的量，其单位为mg/cm2S与e的关系的推导：A＝0.001＝ebc，bc＝0.001/eb为吸取池的厚度，单位为cm，c的单位为mol/L，bc乘以待测物的摩尔质量M(g/mol)，就是单位截面积内待测物的质量，即S=b(cm)´c(mol/dm3)´M(g/mol)´106mg/g＝(mg/cm2例1.某试液用2cm比色皿测量时，T=60%，若改用1cm或3cm比色皿，T及A分别等于多少？解：设某试液用2cm比色皿测量时的吸光度为Ao,用1cm和3cm比色皿测得的吸光度为A1和A2。由于A与T之间的关系是A=-lgT，因此Ao=0.22。根据朗伯-比尔定律可知：A=εb1c，因此A1=A0b1/bo=0.11,T1==0.78.

A2=A0b2/bo=0.33,T3==0.47.例2.已知含Fe2+浓度为500g/L的溶液，用邻二氮菲比色测定铁，比色皿厚度为2cm，在波长508nm处测得吸光度A=0.19，计算摩尔吸取系数。解： 例3.双硫腙显色法测定铅的e＝6.8´104，求桑德尔敏捷度S。解：S＝M/e＝207/6.8´104=0.0030(mg/cm2)9.2目视比色法与分光光度法朗伯—比尔定律是光度法定量分析的基础。能够通过仪器测吸光度，然后通过与原则的比较法或原则曲线法得到被测组分的浓度。也可通过肉眼直接观察颜色的深浅判断组分含量。9.2.1目视比色法是用眼睛观察、比较溶液颜色深度以拟定物质含量的办法。普通采用原则系列法。即在一套等体积的比色管中配备一系列浓度不同的原则溶液，并按同样的办法配备待测溶液，待显色反映达平衡后，从管口垂直向下观察(对于高含量的试样，也可从管侧面观察)，比较待测溶液与原则系列中哪一种原则溶液颜色相似，便表明两者浓度相等。如果待测试液的颜色介于某相邻两原则溶液之间，则待测试样的含量可取两原则溶液含量的中间值。优点是操作简便，适宜于野外或现场快速测定，可在复合光-白光下进行测定，某些不符合朗伯-比尔定律的显色反映，仍可用该法进行测定。重要缺点是精确度不高，原则系列不能久存，需要在测定时临时配制。9.2.21.分光光度计分光光度计按工作波长范畴分类，可分为紫外-可见分光光度计和可见光分光光度计。按照光路的设计方式可分为单光束、双光束和单波长、双波长分光光度计等。尽管分光光度计的种类和型号繁多，但它们都是下列基本部件构成的。(1)分光光度计的重要构成部件：光源、单色器、吸取池、检测器和显示装置。光源：(Lightsource)：光源的作用是提供所需波长范畴内的持续光谱，光源要有足够的光强度，能量分布均匀，稳定。电源电压的微小波动会引发灯光强度的很大变化，因此需要用稳压电源。可见分光光度计的光源多属热光源，如钨灯、碘钨灯等，钨灯发射光谱波长范畴为400～1000nm，在可见和近红外区。碘钨灯发射光谱波长范畴320～2500nm。紫外区使用氢灯或氘灯(180～375nm)。单色器：(monochromator)：将光源发出的持续光谱分解为单色光的装置。比色计的单色器普通是滤光片，分光光度计的单色器普通由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等构成。可见分光光度计惯用玻璃棱镜，玻璃棱镜适合的波长为350～3200nm；紫外-可见分光光度计惯用石英棱镜，这是由于玻璃对紫外光有较强吸取的缘故，石英棱镜适合的波长为185～4000nm。光栅是运用光的衍射与干涉作用制成的色散元件，它含有合用波长范畴宽、分辨性能好和色散均匀等优点。吸取池也称比色皿(coloritrough)：吸取池用来盛放试液。按制作材料可分为石英和玻璃吸取池，前者用于紫外和可见区，后者仅用于可见区。检测器(detector)：运用光电效应，将光能转成电流讯号。惯用的有光电池，光电管，光电倍增管、光电二极管、光导摄象管等。显示装置：检流计、微安表、数字显示统计仪等。(2)几个不同类型分光光度计单光束分光光度计(singlebeamspectrophotometer)，如721型分光光度计为可见光单光束分光光度计的类型。仪器光路示意图以下。双波长分光光度计(doublewavelengthspectrophotometer)、双光束分光光度计(doublebeamspectrophotometer)或双波长—双光束分光光度计：双光束分光光度计是将单色光分成两束，一束通过参比池，另一束通过样品池，经一次测量，检测器直接得到的是样品池与参比池吸光度的差，即。双波长分光光度计是将同一光源发出的光分成两束，以一定的频率交替照射同一吸取池，经光电倍增管和电子控制系统，由批示器显示出两个波优点的吸光度之差，即。运用双波长光度计可消除干扰组分或混浊试样背景对测定的影响，往往可提高办法的敏捷度和选择性。该类型仪器与单光束仪器的比较以下图。光学多通道分光光度计(opticalmultichannelspectrophotometer)是20世纪80年代问世的产品，是一种含有全新光路系统的仪器。由钨灯或氘灯发射的复合光先通过样品池后再经全息光栅色散，色散后的单色光由光二极管阵列中的光二极管接受，一种光二极管阵列普通能容纳数百个光二极管，可覆盖190~900nm波长范畴。全部波长同时被检测，因此响应非常快。这种类型光度计特别适合进行快速反映动力学研究及多组分混合物的分析在环境及过程分析中也非常重要，并可用作高效液相色谱仪和毛细管电泳仪的检测嚣。光导纤维探头式分光光度计(opticalfiberprobe-typespectrophotometer)：探头是由两根互相隔离的光导纤维构成，钨灯发射的光由其中一根光纤传导至试样溶液，再经镀铝反射镜反射后，由另一根光纤传导，通过干涉滤光片后，由光敏器件接受为电信号。这类仪器不需吸取池，直接将探头插入试样溶液中，在原位进行测定。这种类型光度计惯用于环境和过程监测。2.分光光度法根据朗伯-比耳定律，当吸光物质光程一定时，吸光度与吸光物质的浓度成线性关系，因此能够根据直接比较法和原则曲线法测定试样溶液中待测物质的浓度。原则曲线法是先用纯试剂或与被测试样有相似组分的物质配制不同浓度的原则溶液，以不含试样的空白溶液作参比，测量原则溶液的吸光度，绘制吸光度—浓度曲线，以下图所示，此曲线称原则曲线或工作曲线。然后在同样条件下测定试样溶液的吸光度，再由原则曲线上求出被测元素的含量。需要注意的是：在某些状况下，A～c并不严格恪守比尔定律,这种现象称为偏离朗伯-比耳定律。引发偏离朗伯-比耳定律的重要因素在背面的章节中讨论。普通说来，朗伯-比耳定律只合用于稀溶液。9.3分光光度法的设计9.3.1理论上讲，全部对紫外光、可见光有吸取的有机物、无机物都能够用紫外－可见分光光度法进行测定。但在实际工作中，普通使弱吸取物质发生化学反映生成含有强吸取性质的吸光物质，以提高光度测量的精确性和分析办法的敏捷度。此反映称为显色反映，所用的试剂称为显色剂。1．显色反映显色反映普通应满足下列规定：(1)形成的吸光物质的摩尔吸光系数大，办法敏捷。(2)选择性好，干扰少或干扰容易消除；显色剂在测量波优点的无吸取或光吸取小，即测量的吸光物质与显色剂的颜色差别要大。普通规定吸光物质与显色剂的最大吸取波长有关较远。，式中R为显色剂，MR为待测物质与显色剂形成的产物。普通将称作显色反映的对比度。

(3)显色反映产物稳定，在测量过程中吸光度基本保持恒定。(4)显色反映的条件便于控制。2．显色剂显色剂的种类诸多，但无机显色剂在光度分析中应用不多，重要由于敏捷度和选择性不高。例如钼酸铵可作为测硅、磷和钒的显色剂，双氧水可作为钛的显色剂。应用较多的是有机显色剂。有机显色剂及其产物的颜色与它们的分子构造有亲密关系。有机显色剂分子中普通都含有生色团(chromophore)和助色团(auxochrome)。分子中能吸取紫外或可见光的基团称为生色团，生色团中含有不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这此基团中的电子被激发时所需的能量较小，能够吸取可见光而体现出颜色。助色团是含有非键电子对的基团。如氨基、羟基和卤代基等。它们本身并不吸取不不大于200nm的光，但它们可与生色团中电子互相作用，形成非键电子与电子的共轭，即p-共轭，减少了跃迁的能量，引发吸取峰向长波方向移动，使吸取强度增加。3．显色条件的选择显色条件涉及：溶液酸度，显色剂用量，试剂加入次序，显色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。(1)酸度的选择溶液的酸度会影响显色剂的平衡浓度和颜色，也会影响被测金属离子的存在状态和影响络合物的形成反映，是显色反映重要的条件之一。适宜的酸度需通过实验拟定。在实际工作中，普通是固定其它实验条件，变化反映体系的pH值，测量体系的吸光度A，作A~pH曲线，从实验曲线中选择A值大，且随pH值变化平缓的pH值范畴作为酸度控制范畴。(2)显色剂的用量为使显色反映进行完全，需加入过量的显色剂。但有些显色反映，显色剂加入太多，反而会引发副反映，对测定不利。显色剂浓度与吸光度的关系有下列三种状况，要根据实验成果来拟定显色剂的用量。(3)显色反映时间有些显色反映瞬间完毕，溶液颜色很快达成稳定状态，并在较长时间内保持不变；有些显色反映虽能快速完毕，但有色络合物的颜色很快开始褪色;有些显色反映进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定。拟定显色反映时间的实验办法，配制好显色溶液，每隔一定时间测量一次吸光度，制作吸光度-时间曲线，以拟定适宜的显色时间和稳定时间。(4)显色反映温度显色反映大多在室温下进行。但是，有些显色反映必需加热至一定温度完毕。但要注意某些有色化合物在高温时分解。(5）溶剂某些有机溶剂能减少有色化合物的解离度，提高显色反映的敏捷度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮，可使颜色加深。还可能提高显色反映的速率，影响有色络合物的溶解度和构成等。(6)干扰及其消除办法试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定，可采用下列某些方法。a.控制溶液酸度b.加入掩蔽剂c.运用氧化还原反映，变化干扰离子的价态d.运用校正系数e.用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。f.选择适宜的波长g.当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰。h.预先分离的办法。9.3.2为了使测定成果有较高的敏捷度，应选择被测物质的最大吸取波长的光作为入射光，这称为“最大吸取原则”。选用这种波长的光进行分析，不仅敏捷度高，且能减少或消除由非单色光引发的对朗伯-比尔定律的偏离。但是，在最大吸取波优点有其它吸光物质干扰测定时，则应根据“吸取最大，干扰最小”的原则来选择入射光波长。例如丁二酮肟光度法测钢中镍，络合物丁二酮肟镍的最大吸取波长为470nm，但试样中大量的铁用酒石酸钠掩蔽后，在470nm处也有一定吸取，干扰镍的测定。为避免铁的干扰，能够选择波长520nm进行测定，即使测镍的敏捷度有所减少，但酒石酸铁不干扰镍的测定。从仪器测量误差的角度来看，为使测量成果得到较高的精确度，普通应控制原则溶液和被测试液的吸光度在0.2~0.8范畴内。可通过控制溶液的浓度或选择不同厚度的吸取池来达成此目的。9.3.3运用参比溶液来调节仪器的零点，可消除由吸取池壁及溶剂对入射光的反射和吸取带来的误差，扣除干扰的影响。参比溶液选择原则：a试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。b显色剂为无色，被测试液中存在其它有色离子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。c显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。d显色剂和试液都有颜色，可将一份试液加入适宜掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其它试剂均按试液测定办法加入，以此作为参比溶液，这样就能够消除显色剂和某些共存组分的干扰。e变化加入试剂的次序，使被测组分不发生显色反映，能够此溶液作为参比溶液消除干扰。9.4误差

吸光光度法的精确度较高。普通相对误差2～5％。

影响精确度的重要因素有仪器测量误差、非单色光引发的吸光定律的偏离与化学反映平衡移动引发的对吸光定律的偏离等。9.4.1仪器测量误差

任何仪器都有一定的测量误差，对于分光光度计来说，这是由于光源不稳定、电源波动、读数误差等因素造成，属随机误差。根据Lambert-Beer定律能够推导出测量误差的影响因素。若在测定吸光度A时产生了一种微小的绝对误差dA，则测量A的相对误差为：,根据Lambert-Beer定律可得，,微分后得，因此可得：。从Er对T的关系图可知，当A=0.434时，测量的相对误差最小，在A为0.2~0.7范畴内，相对误差较小，因此实际测量时吸光值最佳在此范畴内。6.4.2非单色光引发的误差严格说来，Lambert-Beer定律只合用于单色光，但事实上用多个分光办法所得的入射光都含有一定的带宽，因而造成实际测量值与Lambert-Beer定律偏离。

为尽量避免由于非单色光引发的对吸取定律的偏离，普通选择峰值波长进行测量。6.4.3溶液化学反映引发的误差溶液对光的吸取程度决定于吸光物质的性质和数目，溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新的化合物或互变异构体等化学变化而变化溶液中吸光物的浓度，因而造成偏离Lambert-Beer定律。6.4.4其它影响因素其它影响测量的因素尚有：1.介质不均匀：被测溶液若不均匀，入射光除被吸取外，还可能因散射而损失，使吸光度增加，使原则曲线发生弯曲。2.浓度效应：浓度高时，吸光质点间的静电作用加大，其吸光行为发生变化。3.温度效应：温度变化时，显色反映的平衡常数，吸光质点的摩尔吸光系数均会发生变化。4.酸度效应：

酸度变化时，酸碱性吸光质点或电离、或质子化，造成吸光质点浓度变化。5.溶剂效应：

不同种类的溶剂，性质不同，对不同种类的电子跃迁(如、、跃迁)含有不同的影响，使同一物质在不同溶剂中含有不同的吸取光谱特性。6.5紫外可见吸光光度法的应用比色法、可见分光光度法重要应用于试样中微量组分的测定，也可用于常量组分的测定。它的特点重要有：（1）敏捷度高，这类办法惯用于测定试样中1%～10-3%的微量组分，甚至可测定低至10-4～10-6%的痕量组分。（2）精确度较高。（3）操作简便、快速，仪器构造比较简朴，成本低。分光光度法应用十分广泛，几乎全部的无机离子和许多有机化合物都能够直接或间接地用分光光度法进行测定。随着新的、敏捷度高、选择性好的有机显色剂和掩蔽剂的不停开发，只要通过适宜的化学解决，绝大多数元素都可用分光光度法进行定量测定。另外，分光光度法在对多组分分析以及研究化学平衡、络合物的构成等方面都有广泛的应用。紫外分光光度法与可见分光光度法同样，同属分子吸取光谱，它重要是指波长范畴为200～400nm的近紫外区吸取光谱。紫外分光光度计与可见分光光度计的基本构造大致相似，只是光源多为气体放电光源，如氢灯、氘灯等，其发射光谱约在180～400nm。也可使用激光作光源，激光含有高强度和高单色性，可提高办法的敏捷度和精确度。紫外分光光度计所使用的单色器是能透过紫外光的石英棱镜或光栅。吸取池也必须采用能透