转基因检测技术

食品生物技术与食品安全检测目录一、转基因食品的检测方法目前已有的转基因检测方法主要有两大类：一类是蛋白质水平的检测；另一类是核酸水平的检测。主要方法免疫学方法核酸探针法分子标记法蛋白质水平核酸水平检测目标：DNA,RNA和蛋白质蛋白质DNARNA血清学方法PCR及核酸杂交方法（一）、蛋白质水平检测方法免疫分析技术是通过抗原抗体之间的特异反应来实现的。这种方法的优点是：具有高度特异性，即使在待测样品中有干扰性化合物存在，也能准确识别抗原性物质。免疫学分析技术蛋白质印迹法酶联免疫吸附法（ELISA）试纸条法蛋白质印迹法将电泳较高的分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性结合起来。是检测复杂混合物中特异蛋白质的最有力的工具之一。可确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质，特别是不可溶蛋白质的分析。此方法实际可以应用于转基因RoundupReady大豆原料和大豆蛋白质产品的检测。酶联免疫吸附法ELISA检测是将抗原和抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用结合起来，根据酶作用于底物后的显色反应，当抗原与抗体结合时，借助于比色或荧光反应鉴定转基因食品。优点：提高了检测灵敏度，能产生有颜色的底物，通过仪器或肉眼识别，具有高度选择性、灵敏性和商业可利用性。缺点：复杂的基质对它的准确性和精度性有干扰，并且外源基因表达蛋白质含量低或热处理变性时，此免疫方法的检测能力下降。试纸条法将特异性抗体交联到试纸上，当纸上抗体与特异抗原（待测抗原）结合后，再与带有标记物的特异抗体进行反应，即可在试纸上形成带有颜色的三明治结构。此法不需要特殊仪器，方便携带，适用于现场检测或初筛。（二）、核酸水平检测方法DNA检测法的基础原理是互补的DNA双螺旋的两条链的序列特异性杂交。DNA检测法PCR技术PCR-ELISA巢式定性PCR电化学发光PCR复合扩增PCRPCR技术PCR技术（聚合酶链反应技术）是指模拟体内DNA复制方式在体外选择性扩增DNA某个特殊区域的技术。具有短时间内准确大量复制目的顺序，具有灵敏度较高、特异性强、可准确定量等优点，是目前转基因食品检测中最为成熟的方法。基本要素：模板，引物、合成DNA的原料即dNTP和DNA聚合酶。关键步骤：DNA抽提与纯化。PCR既可做定性又可做定量分析。1、定性PCR技术其原理：转基因食品重组DNA的基本结构包括启动子、目的基因、终止子和标记基因，其中启动子和终止子为表达目的基因所必需的。而现有的商品化转基因食品中绝大多数含花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S、根癌农杆菌转录终止子NOS及抗生素抗性基因NFI’II。人们可通过扩增这些特殊的启动子和终止子序列，鉴定食品中有无转基因成分。目前为止，利用定性PCR检测技术可检测如大豆，玉米、番茄、油菜等多种转基因作物。2、定量PCR技术在定性筛选PCR方法的基础上，引入内部参照反应以消除检测时的干扰，并与已知含量的系列GMO标准样品的PCR结果进行比较，从而可以半定量地检测待测样品中的GMO含量。（1）半定量PCR通过同时扩增待测样品和一系列标准样品中共有核酸成分，由标准品建立的标准曲线来判断待测样品中转基因成分的含量。2、定量PCR技术（2）定量竞争性PCR其基本原理：采用构建的竞争DNA与样品DNA相互竞争相同底物和引物，并根据电泳结果以竞争模板的稀释度和结果做标准曲线，从而得到可靠的定量分析结果。特点：含有内部标准子，可降低实验室之间的测量误差。因此，构建理想的内标是竞争性定量PCR法的关键。2、定量PCR技术（3）实时荧光定量PCR在常规PCR基础上，添加一条标记了两个荧光基团的探针，一个标记在探针的5’端，另一个标记在探针的3’端。优点：采用了独特的全封闭反应，减少了污染，具有高度的灵敏性。缺点：荧光标记探针会在一些食物基质中水解；且操作仪器较贵。应用：日本、韩国和美国等采用这一方法分析了5个转基因玉米品种和1种转基因大豆。它是目前最具应用前景的一种方法。PCR-ELISA将PCR技术与ELISA相结合的方法。既适合快速的定性筛选又可进行准确的定量分析。巢式定性PCR（nested-PCR）由两对巢式引物和两轮PCR扩增所组成。此法极大地提高检测的灵敏度和特异性，避免伴有假阳性或假阴性现象。此法在转基因成分很少时也能检测出来。复合扩增PCR（multiplexPCR）一种高效的针对多个靶位点进行同时检测的技术。具体是在同一反应管中放入一对以上引物，在同一反应中同时扩增两个或多个目标基因序列，可以同时针对几个靶位点进行PCR技术检测。电化学发光PCR（ECL-PCR）新型的基因检测技术，它将电化学发光的高灵敏度与传统分子生物方法的稳定性结合于一体。具有无放射性危害、高灵敏度、操作简便、结果准确的优点。其有望成为一种定量检测转基因植物的方法.（三）、基因芯片基因芯片又称DNA微阵列，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律的排列固定于支持物上形成的DNA分子阵列。可以鉴定和分析