第三章 抗体工程制药

第三章抗体工程制药利用细胞融合技术，将骨髓瘤细胞和淋巴细胞合并成杂交瘤，杂交瘤细胞会持续分泌成分单一、有特异性的抗体。抗原：进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。2.单克隆抗体基本原理1.定义第二节单克隆抗体抗体：动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的免疫球蛋白。一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的抗体，血清中的抗体是多克隆抗体。哺乳动物和人体内主要有两类淋巴细胞：T细胞和B细胞。前者能分泌淋巴因子(如干扰素)；后者能分泌抗体。一个B淋巴细胞可以繁殖为一个单克隆，但B淋巴细胞在体外不能无限地分裂繁殖。癌细胞具有无限增殖的特性。B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，能产生单一抗体又能在体外无限生长的杂合细胞。3.单克隆抗体的制备步骤1）动物免疫经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：体内法或体外法。体内法：抗原直接注射小鼠体内，3－4天后，取出脾制成淋巴悬液，用于融合。体外法：提取大、小鼠淋巴细胞，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。2）骨髓瘤细胞的选择骨髓瘤细胞：能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK（胸腺嘧啶核苷激酶）的缺陷型。3）细胞融合将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7—10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。采用聚二乙醇(PEG)融合。4）HAT培养基筛选杂交瘤细胞DNA生物合成有两条途径：一条由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，这是主要途径。这条途径可氨基喋呤阻断。在有氨基喋呤的情况下，补救途径可以合成DNA，但是需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)参与。杂交瘤技术中常选用HPRT和TK缺陷型骨髓瘤细胞。HAT是含次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基。杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可在HAT培养基中通过补救合成途径合成DNA。在HAT培养基中，HPRT或TK缺陷的亲本肿瘤细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。5）杂交瘤细胞的克隆化培养HAT培养基筛选杂交瘤细胞分泌多克隆抗体，单个细胞系分泌特异抗体才为单克隆抗体。分离单个细胞系方法：有限稀释法、软琼脂培养法等。有限稀释法取出阳性孔内的细胞进行计数；用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞；如果每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞；经过8~12天后，可观察到有集落生长的孔；根据检测的阳性结果再次进行克隆化；将细胞悬液稀释至一定体积内只含有一个细胞，取这个体积的悬液培养成单克隆。软琼脂培养法在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。0.25％的软琼脂培养杂交瘤细胞，毛细管吸出细胞克隆。6）单抗的大规模生产将稳定分泌单抗的细胞株，接种于小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖。利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗。第三节基因工程抗体一、基因工程抗体的特点（与单克隆抗体比较）1．通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应。3．根据治疗的需要，制备新型抗体；2．基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；4．可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。基因工程抗体：采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。二、基因工程抗体的应用1.在肿瘤治疗方面肿瘤生长因子的封闭。阻断受体信号传导。抗血管生成。抗体与毒素融合，特异性治疗肿瘤。2.在治疗病毒病方面3.在治疗自身免疫病方面的应用4.在哮喘、移植排斥、血管疾病等方面此外，在疾病诊断方面。第四节抗体的氨基酸顺序抗体分子的基本结构是由四肽链组成的。即：由二条相同的分子量较小的肽链(轻链)和二条相同的分子量较大的肽链(重链)组成。两条重链(H)糖基化和两条轻链(L)非糖基化；每条重链和轻链分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。轻链（L）约220个氨基酸残基组成，分子量为24kD，有两个由链内二硫键组成的环肽，L链可分为：Kappa（κ）与lambda（λ）2个亚型。重链（H）约440-550个氨基酸残基组成，分子量55-75kD，4-5个链内二硫键，可分为5类，μ、γ、α、δ、ε链。不同的H链与L链（κ或λ）组成完整的Ig分子。分别称为：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE。可变区和恒定区：H链或L链的N-末端序列变化很大，称为可变区（V区）；C-末端氨基酸则相对稳定，变化很小，称为恒定区（C区）。可变区位于L链（VL）N端1/2处，H链（VH）N端1/5-1/4处。可变区可分为高变区（hypervariableregion，HVR）和骨架区（frameworkregion，FR）。高变区为抗体与抗原的结合位置，称为决定簇互补区（complementarity-determiningregion，CDR），VL和VH的HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2，CDR3。恒定区（constantregion，C区）：L链C端1/2处，H链C端3/4-4/5处。在同一种属动物中是比较恒定的，是制备第二抗体进行标记的重要基础。铰链区和J链依据抗体的氨基酸保守保守区域设计引物，不同功能区的氨基酸变化，设计不同功能的新型抗体。1.嵌合抗体

从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。第五节抗体分子的克隆基因工程抗体的种类（2）人源化抗体(改型抗体)

将小鼠的CDR（complementaritydeterminativeregion）序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。（3）完全人源化抗体（全套抗体库）

采用基因敲除术将小鼠Ig基因敲除，代之以人Ig基因，然后用Ag免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。（4）单链抗体用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。（5）双价抗体与双特异性抗体许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合

位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两

个抗原分子连接。第六节筛选抗体克隆的展示技术一、噬菌体展示技术噬菌体属于单链DNA病毒，包括f1、fd和M13等；（一）原理噬菌体DNA在细菌内滚环复制,细菌不被裂解,但生长速度减慢,而且可分泌出大量成熟的噬菌体颗粒；丝状噬菌体基因组编码10种蛋白质，其中5种为结构蛋白，与噬菌体展示密切相关的是二种不同的结构蛋白pⅢ和pⅧ；M13噬菌体在pⅢ和pⅧ衣壳蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时保持的外源基因天然构象，也能被相应的抗体或受体所识别；利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。（二）技术流程1.噬菌体抗体库的构建用B淋巴细胞全套抗体可变区基因克隆并组装成的噬菌体变异群体称为噬菌体抗体库抗体库构建的一般过程①从可变区基因来源中分离RNA。②互补DNA第1条链的合成。③构建可变区基因的PCR和可变区基因文库。④进行载体和可变区基因文库的限制性消化和连接。⑤感染大肠杆菌并表达目的基因。⑥筛选抗体。2.特异性噬菌体抗体库的筛选和富集（1）吸附结合固相筛选：即将靶抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体。液相筛选：即将靶抗原与生物素相连，再将其固定在包被有链亲和素的磁珠上，在磁场的作用下将非特异性噬菌体和特异性噬菌体分开。细胞表面筛选：将靶抗原定位于细胞表面，从而以完整细胞进行筛选。细胞内化筛选。（2）洗脱（3）扩增富集（4）筛选效率的检测（5）克隆的鉴定2.酵母双杂交技术细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与；转录激活因子在结构上相互独立