电泳八年制(法)

生物化学实验(八年制）细胞与分子生物学实验教学平台

电泳课程安排生化四大基本技术电泳（P5,P14,P16）层析（P23,P30,P32,P35）分光光度法（比色法）离心法分子生物学实验（鼠肝actin基因的检测）（P109,P58）（P123）课程要求重视过程，重视结果分析注意融会贯通，方法应用考试平时成绩实验操作标记用铅笔在薄膜无光泽面一端2cm处画一细线，在右上角做好标记。

浸泡将醋酸纤维素薄膜无光泽面向下，在缓冲溶液中浸泡，使其充分浸透。

点样

用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体(不要太干），利用载玻片

一侧蘸取样品，于细线处点样。

电泳

将薄膜无光泽面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负

极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。

染色将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂，染色5min。

漂洗将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次。醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白电泳技术发展概念基本原理影响因素种类应用

TheNobelPrizeinChemistry1948

Arne

Tiselius

1808年俄国物理学家Reŭss发现电泳现象。1937年瑞典科学家Tiselius首先设计出世界上第一台自由电泳仪，并建立了“移界电泳”分离模式。以电泳作为一种分离技术，首先证明了血清蛋白是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的。

"forhisresearchonelectrophoresisandadsorptionanalysis,especiallyforhisdiscoveriesconcerningthecomplexnatureoftheserumproteins"发展20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。如今，各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。电泳的基本概念带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)

。带电粒子由于带电性质及电荷量不同，在一定的电场强度下具有不同的移动速度及方向。电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。电泳用于分离物质的原理（1）电荷量及方向：蛋白质为例等电点电泳用于分离物质的原理（2）迁移率：以来表示，即单位电场强度时粒子运动的速度，取决于带电粒子的电荷量Q、粒子大小γ和形状。电泳用于分离物质的原理（3）具体实验中：

V:泳动速度cm/秒or分d:泳动距离cmt:电泳时间(秒/分)E:电场强度伏特/cmu:泳动率or泳动度(cm2/伏·秒or分)U:电压l:支持场的长度(有效长度)设：混合物中有A、B两物质：物质A在电场中移动的距离为:dA=AVt/l

物质B的移动距离为：dB=BVt/l

则两物质移动距离之差为：

Δd=(dA-dB)=(A-B)Vt/l

即：物质A、B能否分离取决于两者的迁移率

影响电泳速度的因素：内因

1.净电荷：被分离物带电荷量与电泳速度成正比

2.质点大小：颗粒直径愈小愈快，分子大小与电泳速度成反比

3.质点形状：球形分子比纤维状分子泳动快。影响电泳速度的因素：外因（1）溶液的pH值

决定带电粒子的解离的程度，即该物质带净电荷多少的决定因素。对蛋白质等两性电解质而言，pH值离等电点越远，则颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快，反之，则越慢。为了使电泳过程中溶液pH值恒定，必须采用缓冲溶液。一般常用的电泳缓冲液pH范围在4.5~9.0。影响电泳速度的因素：外因（2）溶液的离子强度

维持一定的缓冲容量，需要一定浓度的离子，它主要与其浓度和价数相关。I=1/2CZ2

缓冲液I越大，样品电流减小，泳动速度变慢，区分条带清晰；过高会压缩质点的双电层，最后破坏胶体，不能泳动。

I越小，则泳动速度快，条带分离差，过低，缓冲容量小，PH不稳定，样品易扩散。一般在0.02-0.2。

影响电泳速度的因素：外因（3）电场强度

是指电场中每厘米的电位降，也称电位梯度或电势梯度。电场强度对电泳的速度起着重要作用，电场强度高，带电颗粒泳动速度快，电场强度低，带电颗粒泳动速度慢。电压越高，产热增加，高压电泳需备冷却装置。

否则？影响电泳速度的因素：外因（4）支持介质：(1)物理化学性质稳定：在电泳过程中不受环境因素的影响，保持原有的状态和性能。(2)化学惰性：在电泳过程中不与缓冲系统中的各种离子和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子的电泳过程。(3)分布均匀：内电渗小，结果重复性好电渗：液体对固体支持物的相对移动，在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定方向移动。

种类：自由界面电泳区带电泳：纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。连续系统：电荷效应、分子筛效应不连续系统：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应盘状平板式垂直板式电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电泳技术的应用分离纯化样品测定分子量组建物理图谱鉴定重组体分子杂交测序PCR检测分子标记检测醋酸纤维薄膜：是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中。（醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白）聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。（等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素C）琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。

聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质实验内容：

原理：以醋酸纤维薄膜为支持物，在PH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离，醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白表-1血清中各蛋白质的相关特性种类分子量(万）PI分布(%)清蛋白1-球蛋白2-球蛋白-球蛋白-球蛋白6.95.09.013.011.04.85.05.05.26.8-7.5552.1~30.84.1~72.51.2~2515.6蛋白质染料氨基黑10B

酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。这类染料对不同的蛋白质结合量不同，染色不均一和高背景影响蛋白质的定量。染色灵敏度较低，现在这类染料已很少应用，被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。优缺点醋酸纤维薄膜广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中，如血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。它具有简单快速、对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带更清晰等优点，电渗作用虽然较高但很均一，不影响样品的分离效果。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，由于薄膜厚度小（约10～100μm），样品用量很少，不适于制备

前清蛋白

清蛋白-球蛋白-球蛋白临床意义：白蛋白：主要在肝脏合成，所以与肝脏疾患密切相关。α球蛋白的增加与发热有关，与炎症有关。Β球蛋白增加常伴随血中脂质的增加。Γ球蛋白含有抗体成分，在许多慢性感染、免疫性疾病中有异常。例如：多发性骨髓瘤病人在Β球蛋白与Γ球蛋白之间出现一个尖峰：M蛋白肝硬化病人Γ球蛋白增加，白蛋白降低。聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分离Hb和细胞色素C细胞与分子生物学实验教学平台Xu_weirong@163.com

聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IsoelectricFocusing，简称IEF)：

利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自PI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。原理：蛋白质是两性电解质蛋白质由于等电点的不同而带有不同的电荷性质。在电场下发生移动，当它们达到净电荷为零时停止迁移，分别聚焦在各自等电点相应的pH位置，这种行为称为聚焦反应。蛋白质在等电聚焦电泳中的分离仅仅决定于其等电点，达到稳态后，如