分子生物学第二章

第二章遗传的物质基础——DNA遗传物质的本质核酸的化学组成DNA的二级结构DNA二级结构的其他形式DNA的超螺旋结构及拓扑异构现象DNA携带着两类不同的遗传信息一类是负责蛋白质氨基酸组成的信息，是以三联体密码子方式进行编码的。另一类遗传信息是关于基因选择性表达的信息。基因组中大部分DNA序列是用来编码基因选择性表达信息的。这种选择性除了时序调节和环境调控外，某些调控DNA序列还可以与调控蛋白质相互作用而修饰自己的双螺旋空间结构。Somegenesinhibitothergenes;supposeproteinYstickstoDNAattheprecisepatternCAGGCGgenePromoterCAGGCCG一、遗传物质的本质（一）DNA是遗传物质原有实验基础：1869年，德FriedrichMiescher分离出一含磷物质—核素（nuclein）（即脱氧核糖核蛋白），是首次研究遗传物质的化学本质。1885—1900年间，Kossel、Johnew、Levene证实核酸由不同的碱基组成。其最简单的单体结构是碱基-核糖-磷酸构成的核苷酸。1929年又确定了核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸(DNA)，另一种是核糖核酸(RNA)。20世纪30年代，P.Levene和W.Jacobs等搞清了DNA和RNA的基本化学组成。他们还注意到了DNA和RNA所包含核糖的差异。1928年，英国细菌学家FrederickGriffith发现了肺炎链球菌的转化现象，这一发现表明活的无毒R型细菌从死去的有毒S型菌得到了一些什么东西从而使无毒的R型转化成有毒的S型肺炎球菌。但转化源（transformingprinciple）的化学本质仍是一个谜。1928年，Griffith

肺炎双球菌的转化1944年，Avery等用有机溶剂去除蛋白、用胰蛋白酶（trypsin）和胰凝乳蛋白酶（chymo-trypsin）消化蛋白对转化没有影响，但DNA酶消化使转化作用不能发生。

Avery等对转化物质又进行了超速离心、电泳、紫外分光光度测定等一系列分析，发现转化物质具有高分子量、高电泳迁移率等特性，在260nm波长有光吸收，N/P比在1.67左右。这些都已经说明转化源就是DNA。人们仍不相信DNA是遗传物质,这是由于：（1）因认为蛋白分子量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而DNA分子量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。（3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。1944年，Avery在离体条件下完成转化1952年，美国冷泉港实验室Hershey和Chase大肠杆菌噬菌体捣碎实验确证了DNA是遗传物质。他们用32P和35S分别标记噬菌体的DNA和蛋白质，发现只有DNA进入宿主细菌内，而蛋白质则没有。1952年，Hershey和Chase噬菌体感染实验1953年，DNA双螺旋结构模型的提出才真正确立了DNA是遗传物质的观点。(二)RNA也可以作为遗传物质所有已知的有机体和许多病毒的遗传物质都是DNA双螺旋，但一些病毒也采用另一种核酸－RNA作为遗传物质，如逆转录病毒。1956年A.Gierer和G.Schraman发现烟草花叶病毒TMV（tobaccomosaicvirus），其遗传物质是RNA。类病毒（viroid）只由很小的环状RNA分子组成，其RNA本身就是一个感染因子。是否存在核酸以外的其他遗传物质？

朊病毒是迷一样的感染性粒子。目前唯一鉴定的组分是蛋白，所以这种感染性粒子不是核酸，而是一种蛋白质病原，称为朊病毒（prion）。朊病毒蛋白（prionprotein，PrP）以两种形式存在：正常的脑组织中发现的PrPC不具有感染性，对蛋白酶敏感，可以被完全降解；而PrPSC具有感染性，具有抗蛋白酶的性能。PrPC和PrPSC的一级结构完全相同，但二级结构却有很大差异正常朊蛋白构型发生异常改变后导致疯牛病，无需DNA或RNA的参与，致病因子朊蛋白就可以传染复制。所谓朊病毒的繁殖就是正常的PrPC蛋白质转变为PrPSC的过程，而且朊病毒感染后也具有指数增长的特性。朊病毒的繁殖过程实际上就是朊病毒PrPSC和PrPC结合，以PrPSC为模板把PrPC的立体构型的信息输入到PrPC的过程。因为这是个繁殖过程，自然就是一个遗传信息的传递过程。这种遗传过程是蛋白质和蛋白质之间遗传信息的输出与输入的过程。二、核酸的化学组成含氮碱基核苷核苷酸DNA的一级结构（即DNA分子中核苷酸的排列顺序，蕴藏了遗传信息，并决定了DNA的二级和高级结构）核酸是线性多核苷酸长链，基本结构单位是核苷酸。核苷酸是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成的磷酸酯类化合物，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类。核苷是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的化合物。核酸中的碱基分为两类：嘧啶碱和嘌呤碱腺嘌呤鸟嘌呤β1’β1’N9N1腺苷(AR)脱氧胞苷(dCR)核苷核苷酸DNA的甲基化（MythylationofDNA）原核生物：多为对一些酶切位点的修饰，作用是对自身DNA产生保护作用。真核生物：在基因表达调控中起主要作用。动物基因组中约2%--7%的胞嘧啶是被甲基化的，形成5-甲基胞嘧啶。三、DNA的二级结构（一）Watson—Crick右手双螺旋结构模型1、实验根据

X射线衍射方法研究DNA纤维的结构.1938年Astbury&Bell用x衍射技术研究DNA。1947年拍摄了第一张DNA的衍射照片，并推断DNA分子的结构是：①柱状；②多核苷酸是一叠扁平的核苷酸；③核酸残基取向和分子长轴垂直,间距为3.4Å。1950年，Chargaff从大量的不同来源的DNA样品的分析中发现了DNA组成的当量规律，即A＝T，G＝C，A＋G＝C＋T。1951年，Pauling和Corey运用化学的定律来推理，而不做具体的实验，建立了蛋白质的α-螺旋模型；Franklin&Wilkins在1952年底拍得了DNA结晶X衍射照片。

1951年，Pauling提出了蛋白质的α-螺旋结构。1952年，Wilkins和Franklin用高度定向的DNA纤维作出高质量的X-光衍射照片1953年，Watson和Crick提出DNA的反向平行双螺旋模型

1962年，Wilkins、Watson和Crick共获诺贝尔化学奖。DNA双螺旋2、Watson—Crick右手双螺旋结构模型的要点主链碱基对螺旋参数大沟和小沟双螺旋模型有以下特点：(1)DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋。(2)糖一磷酸键是在双螺旋的外侧，碱基对与轴线垂直。(3)糖与附着在糖上的碱基近于垂直。(4)碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧啶。(5)DNA双螺旋有大沟（majororwidegroove）和小沟（minorornarrowgroove）的存在。主链脱氧核糖和磷酸通过3’,5’磷酸二酯键交互连接，成为螺旋链的骨架（backbone）。两条链方向以反向平行的方式组成右手双螺旋。碱基对

只有A和T配对，G和C配对才能满足正常螺旋（直径20Å）的要求和chargaff的当量规律。氢键配对碱基之间能够形成氢键，而同一条链中的相邻碱基形成一种碱基堆积力。两种力量的协同作用维持了双螺旋结构的稳定性。螺距

每个螺距为34Å，其中含有10个核苷酸。B型双螺旋DNA的结构特征bHLH转录因子对DNA大沟的识别大沟和小沟对于遗传上有重要功能的蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特定信息是非常重要的。（二）维持DNA双螺旋稳定性的因素

1、氢键GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，这是DNA双螺旋结构的重要特征之一，DNA的许多物理性质如变性、复性以及Tm值等都与此有关。碱基配对及氢键形成DNA双螺旋结构的呼吸作用DNA双螺旋结构中，配对碱基之间的氢键处于连续不断的断裂和再生的动态平衡之中。2、碱基堆积力碱基堆积作用对维持DNA的二级结构起着主要作用，它是碱基对之间在垂直方向上的相互作用。它包括：疏水作用、范德华力等。

疏水作用力使DNA相邻的碱基有相互堆集在一起的趋势，这是形成碱基堆集力的重要因素之一。DNA双链中存在大量的嘌呤环和嘧啶环，其累积的范德华力是相当可观的，这是形成碱基堆集力的另一个重要因素。氢键与碱基堆积力的协同作用

已经堆积的碱基更容易发生氢键的键合，相应地已经被氢键定向的碱基更容易堆集。两种作用力相互协同，形成一种非常稳定的结构。如果一种作用力被消除，另一种作用力也大为减弱。带负电荷的磷酸基的静电斥力

DNA溶液中的离子浓度降低时，阳离子在磷酸基周围形成的屏蔽作用减弱，使得磷酸基地静电斥力增大，因而Tm值随之降低。所以纯蒸馏水中的DNA在室温下就会变性。碱基分子内能

温度升高，碱基分子内能增加时，碱基的定向排列遭受破坏，削弱了碱基的氢键结合力和碱基的堆集力，会使DNA的双螺旋结构受到破坏。总之，氢键和碱基堆集力有利于DNA维持双螺旋结构，而静电斥力和碱基分子内能则不利于DNA维持双螺旋结构。（三）DNA的变性、复性、杂交DNA的变性

当DNA被加热或在某些试剂的作用下，配对碱基之间的氢键和相邻碱基之间的碱基堆集力就会受到破坏，DNA由天然状态转变为近似无规则线团构型的过程称为变性（denaturation），又称为熔解（melting）。常用的DNA变性方法主要是热变性和碱变性方法。pH11.3时，全部氢键都被破坏，DNA完全变成单链的变性DNA。

DNA变性后会引起光吸收的增加，即增色效应。DNA的复性

变性的单链DNA重新形成双螺旋结构的过程称为复性（renaturation）。复性的条件有两个：（1）有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力；（2）有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高，一般使用比Tm低20－25℃。pH；温度；GC含量离子强度；分子长度；复性的机制

一般认为需要10－20个碱基对，特别是富含GC的节段首先形成一个（或几个）双螺旋核心，这一步叫成核作用。然后两条单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构。绝大部分的复性DNA分子都不是原配的。杂交复性DNA中，如果两条链的来源不同，就叫杂交分子。DNA和DNA杂交技术、DNA和RNA杂交技术以及RNA和RNA杂交技术分子生物学中占有很重要的地位。如：Southern杂交；Northern杂交；斑点杂交；原位杂交（包括菌落原位杂交和组织原位杂交）等。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交

斑点杂交酵母芯片PCR：变性－退火－延伸（四）双螺旋结构的基本形式DNA的分子构型(B,Z,A)比较

FormBZAHelixDirectionRightLeftRightbp/circle101210.7Distance/bp~0.34nm~0.38nm~0.25nmDistance/helix3.4nm4.46nm2.8nmDiameter/helix2.0nm1.8nm1.9nmSequenceAnyPolyG-CAnyPolyC-APolyT-GPolyT-A

在相对湿度75％以下获得的DNA纤维具有不同与B-DNA的结构特点，称为A构象。DNA-RNA杂交分子和RNA-RNA双链结构均采取A构象。Z-DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤和嘧啶交替排列所造成的，比如CGCGCGCG或CACACACACA。Z-DNA的出现在热力学上是不利的，因此Z-DNA会在DNA链上形成一个局部的不稳定区，成为潜在的解链位点。而解链是复制和转录的中心环节，因此Z-DNA与基因调节有关。B-DNA是活性最高的DNA构象，B-DNA和Z-DNA之间的变构是转录调节的一种模式。首次揭示Z-DNA分子的生物功能，科学家怀疑这个Z-DNA分子根本就是细胞自己产生的突变剂(mutagen)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2006在活的生物体内，不论是DNA的二级结构还是高级结构，都存在一个动力学的平衡。目前已知DNA双螺旋结构可分为A、B、C、D及Z型等数种，除Z型为左手双螺旋外，其余均为右手双螺旋。

Z-DNA B-DNA四二级结构的其他形式（一）单链核酸形成的二级结构

RNA是主要的单链核酸，RNA分子内部存在部分序列之间的碱基配对，核酸链自身回折配对产生反向平行的双螺旋结构，叫发夹结构（hairpin）。发夹结构由碱基配对的双螺旋区—茎和末端不配对的环构成。（二）反向重复序列（invertedrepeats），又称回文序列（palindrome）较短的回文结构可能是作为一种信号，如限制性内切酶的识别位点。另外，转录作用的终止与回文结构也有关系。反向重复可形成单链或双链形式的二级结构。（三）端粒DNA四链结构：鸟嘌呤四聚体（四）三螺旋DNA五、DNA超螺旋和拓扑异构现象绝大多数原核生物都是共价封闭环（covalentlyclosedcircle）,简称CCC分子。这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构（superhelix或supercoil）。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式。超螺旋是有方向的，有正超螺旋和负超螺旋两种。DNA的超螺旋结构超螺旋形成示意末端固定的线型双螺旋额外的张力不能释放双螺旋以扭曲方式缓解应力，形成超螺旋原核生物DNA的三级结构绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋结构。

所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶（topoisomerase）产生的。DNA拓扑异构酶催化反应的本质是先切断DNA的磷酸二酯键，改变DNA的链环数之后再连接之，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能。TopI(swivelase,niking-closingenzyme)Breakage&rejoiningofS.S.DNAatphosphoricesterbonds减少L（在酶的作用下，DNA单链断裂）松弛双螺旋消除负超螺旋CCC→OConlyNoATP,NADattachnegativesupercoilGetenergyfromnegativesupercoilTopII(gyrase)ATPneededCutting&ligationofD.S.DNA使松弛的双螺旋紧缩双螺旋引入负超双螺旋AABtetramerCutD.S.DNAATPLigateB超螺旋DNA分子的结构紧密，有较大的沉降