国自然申请攻略-04基金标书-立项依据逻辑框架

基金书标立项依据逻辑框架逻辑的魅力小说

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「说服力」1框架性思维2按“套路”走3不只是简单拼凑目录1框架性思维2按“套路”走3不只是简单拼凑PART01辗转反侧，立项依据如何下笔？先理清思路！做好框架！再动笔！「」我们的科学假说是如何得来的？前期准备，做到心中有数12345科学问题X具有Z效应临床问题发现XX作用于Y「」1框架性思维2按“套路”走3不只是简单拼凑PART02为了验证假说并解决问题，我们打算做什么项目内容？边写边问7个问题！1234567要解决的临床问题是什么？为解决这个临床问题，别人做了什么科学研究？别人的科学研究中，有哪些是没有解决的科学问题？为了解决这些科学问题，我们做了什么前期研究？我们的前期研究中，有哪些需要进一步探索？我们的科学假说是什么？「」这是评审专家关心的也是我们需要逐一解决的按“套路”走HOW?「」六步走Mini-review600-800字提出临床问题Mini-review800-1000字聚焦科学问题Mini-review600-1000字引入研究对象提出科学假设前期工作实验证据概括项目研究内容文献佐证按“套路”走「」（1）老龄心肌缺血/再灌注（IR）损伤与缺血预适应（IPC）保护人口老龄化是当今世界一个突出性的社会问题，我国人口老龄化发展速度尤其之快。提高老年人的生活质量，已经成为全社会研究的重要课题。冠心病是引起老年人死亡的最常见原因，其基本病理生理过程是心肌缺血，尽早恢复缺血心肌的血液供应能够挽救缺血心肌，但再灌注引起缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusioninjury,IRI）。缺血预适应（ischemicpreconditioning,IPC）是心肌保护的新概念，是迄今为止最强的内源性心肌缺血保护方法。但由于老龄心肌细胞发生退行性变，心肌细胞自噬能力降低，线粒体功能下降（mtDNA突变），氧化应激增强，老龄导致内源性保护物质的生成减少以及IR损伤中发重要作用的蛋白质（膜受体、下游的激酶、磷酸酶、促炎细胞因子等）表达/活性发生改变等，导致老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性减弱或消失。因此，迫切需要有效的措施改善或恢复老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性，提高老龄心肌抗缺血损伤的能力，进而提高老年人的生存率。

——见附件-案例1《外源性多胺恢复老龄大鼠心肌缺血预适应保护作用的机制研究》

社会问题临床问题社会需求临床现象Step1提出临床问题「」大背景介绍：XX疾病目前现状（流行病学），简要介绍你研究的疾病及其危害。Step1提出临床问题社会需求老龄化现象冠心病目前已有治疗手段缺血性预适应对老年人的效果不好疾病临床现象疾病治疗问题社会问题「」Tips要解决的临床问题是什么？回答问题Step1提出临床问题「」据实说明问题的严重性引入数值等更具可信度，更有说服力

TipsStep1提出临床问题「」（2）多胺代谢带有多价正电荷的小分子多胺（polyamine,PAs）包括精胺（spermine,SP）,精脒（spermidine,SPD）及腐胺（putrescine,PU），广泛存在于迄今人们所研究的所有真核细胞和原核细胞内，为细胞的生长、分化和增殖所必需，并在许多病理过程中发挥重要作用……因此，SSAT过度激活（多胺分解代谢增强）引起组织细胞损伤.（3）多胺的生物学作用多胺具有广泛的生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、调控线粒体通透转运（MPT）、调控离子通道、促细胞增殖及在细胞内信号转导中发挥重要作用等……Eisenberg证明精脒延长寿命的机制是通过抑制组蛋白乙酰转移酶使组蛋白去乙酰化，进而转录激活自噬相关基因atg7,atg11和atg15,诱导细胞自噬。（4）衰老心肌自噬能力下降及其影响的下游事件自噬是存在于真核细胞中的生命现象，通过自噬清出细胞内受损的蛋白质和细胞器，维持细胞内稳态，对生物体正常发育及防治老化有积极的作用。分子水平上的研究发现，调节自噬和调节衰老的信号通路之间存在相互联系……因此提示：衰老的心肌细胞→自噬能力下降→老化和受损的线粒体堆积→氧自由基产生增加→mPTP开放数目增加→细胞凋亡。这可能是老龄心肌丧失缺血预适应保护作用的重要机制。小分子多胺在这一级联反应中发挥怎样的作用?还不清楚？

Step2聚焦科学问题小背景介绍：由XX疾病，再趋向本课题研究的方向进行切入与引导，让评委容易跟随作者的思路！层层深入见附件-案例1

开始提炼关键词科学问题雏形「」小背景介绍：由XX疾病，再趋向本课题研究的方向进行切入与引导，让评委容易跟随作者的思路！层层深入从临床问题过渡到科学问题！Step2聚焦科学问题「」不要泛泛而谈层层递进有理有据

TipsStep2聚焦科学问题「」再来一个栗子——见附件-案例2《内质网介导的细胞凋亡和炎症及破骨细胞分化信号通路在假体周围骨溶解骨组织中的作用及机制研究》

小结「」——见附件-案例2

国内外动态+预实验+前期研究对科学问题进一步明确Step3引入研究对象「」为解决这个临床问题，别人做了什么科学研究？别人的科学研究中，有哪些是没有解决的科学问题？Step3引入研究对象回答问题「」

我们在前期研究中，临床上获取了胃癌组织及其癌旁组织样本，采用qRT-PCR检测其表达水平，发现miR-488在胃癌组织中显著低表达。接着通过在线预测软件microRNA.org确定了AREG和相应miR-488结合的靶位点，AREG3‘-UTR与miR-488序列间存在特异结合区域，说明AREG是miR-488的靶基因（见研究工作基础）。因此，根据预实验结果和相关文献证据，我们提出了以下假说：在胃癌细胞中，miR-488下调AREG基因的表达，减少了其与EGFR的结合，从而抑制了ERK通路相关蛋白的表达，导致胃癌血管新生受阻，减少细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，且对化疗敏感性有一定影响（见图3）。

——见附件-案例3《miR-488靶向调控AREG基因介导ERK信号通路对胃癌血管生成及化疗敏感性的调控机制》

Step4提出科学假设

我们在前期研究中，临床上获取了胃癌组织及其癌旁组织样本，采用qRT-PCR检测其表达水平，发现miR-488在胃癌组织中显著低表达。接着通过在线预测软件microRNA.org确定了AREG和相应miR-488结合的靶位点，AREG3‘-UTR与miR-488序列间存在特异结合区域，说明AREG是miR-488的靶基因（见研究工作基础）。因此，根据预实验结果和相关文献证据，我们提出了以下假说：在胃癌细胞中，miR-488下调AREG基因的表达，减少了其与EGFR的结合，从而抑制了ERK通路相关蛋白的表达，导致胃癌血管新生受阻，减少细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，且对化疗敏感性有一定影响（见图3）。——见附件-案例3《miR-488靶向调控AREG基因介导ERK信号通路对胃癌血管生成及化疗敏感性的调控机制》

「」图3？Step4提出科学假设

我们在前期研究中，临床上获取了胃癌组织及其癌旁组织样本，采用qRT-PCR检测其表达水平，发现miR-488在胃癌组织中显著低表达。接着通过在线预测软件microRNA.org确定了AREG和相应miR-488结合的靶位点，AREG3‘-UTR与miR-488序列间存在特异结合区域，说明AREG是miR-488的靶基因（见研究工作基础）。因此，根据预实验结果和相关文献证据，我们提出了以下假说：在胃癌细胞中，miR-488下调AREG基因的表达，减少了其与EGFR的结合，从而抑制了ERK通路相关蛋白的表达，导致胃癌血管新生受阻，减少细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，且对化疗敏感性有一定影响（见图3）。——见附件-案例3《miR-488靶向调控AREG基因介导ERK信号通路对胃癌血管生成及化疗敏感性的调控机制》

「」简洁清爽style高端大气styleStep4提出科学假设「」Anyway！一图胜千言！分子机制图很必要！Step4提出科学假设「」我们的科学假说是什么？回答问题Step4提出科学假设「」情况1：申报人前期基础扎实（延续性研究）前期我们在国家自然科学基金课题的资助下（NO.30770878，2007-2010，本人为课题主持人）在离体灌流成年大鼠心脏上首次发现，IPC处理能够上调成年大鼠心肌的多胺合成代谢（多胺合成限速酶ODC表达增加，总多胺池增加），给予ODC特异性抑制剂α-difluoromethylornithine(DFMO)取消了IPC介导的心肌保护作用，证明多胺是介导IPC心肌保护作用的内源性信号分子（见后面工作基础）；进一步证明IPC诱导的ODC/多胺通路上调主要与PKC、Erk1/2、PI3K/Akt信号转导通路的激活有关。文章发表在MolCellBiochem.2009(332)135–144上。之前我们的另一项国家自然科学基金资助课题(NO.30470688，2005—2007,本课题申请人为第二完成人）的研究发现,缺血/再灌注(IR)损伤心肌多胺代谢失衡，腐胺增加，精脒、精胺减少总多胺池耗竭。外源性精胺(1mmol/L)能补充细胞内的多胺池，并通过下调死亡受体通路、抑制线粒体凋亡通路、清除自由基、抑制细胞内钙超载发挥心肌保护作用。文章发表在EuropeanJournalofPharmacology2007,（562）236–246.上（见后面工作基础）。

——见附件-案例1

Step5前期实验证据「」情况1：申报人前期基础扎实（延续性研究）

前期我们在国家自然科学基金课题的资助下（NO.30770878，2007-2010，本人为课题主持人）在离体灌流成年大鼠心脏上首次发现，IPC处理能够上调成年大鼠心肌的多胺合成代谢（多胺合成限速酶ODC表达增加，总多胺池增加），给予ODC特异性抑制剂α-difluoromethylornithine(DFMO)取消了IPC介导的心肌保护作用，证明多胺是介导IPC心肌保护作用的内源性信号分子（见后面工作基础）；进一步证明IPC诱导的ODC/多胺通路上调主要与PKC、Erk1/2、PI3K/Akt信号转导通路的激活有关。文章发表在MolCellBiochem.2009(332)135–144上。之前我们的另一项国家自然科学基金资助课题(NO.30470688，2005—2007,本课题申请人为第二完成人）的研究发现,缺血/再灌注(IR)损伤心肌多胺代谢失衡，腐胺增加，精脒、精胺减少总多胺池耗竭。外源性精胺(1mmol/L)能补充细胞内的多胺池，并通过下调死亡受体通路、抑制线粒体凋亡通路、清除自由基、抑制细胞内钙超载发挥心肌保护作用。文章发表在EuropeanJournalofPharmacology2007,（562）236–246.上（见后面工作基础）。

——见附件-案例1

Step5前期实验证据既往国自然主持情况（相关项目）既往文章发表情况（相关课题）「」

我们在前期研究中，临床上获取了胃癌组织及其癌旁组织样本，采用qRT-PCR检测其表达水平，发现miR-488在胃癌组织中显著低表达。接着通过在线预测软件microRNA.org确定了AREG和相应miR-488结合的靶位点，AREG3'-UTR与miR-488序列间存在特异结合区域，说明AREG是miR-488的靶基因（见研究工作基础）。因此，根据预试验结果和相关文献，我们提出了以下假说：在胃癌细胞中，miR-488下调AREG基因的表达，减少了其与EGFR的结合，从而抑制了ERK通路相关蛋白的表达，导致胃癌血管新生受阻，减少细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，且对化疗敏感性有一定影响（见图3）。情况2：申报人前期基础较差，且相关的前人研究太少Step5前期实验证据「」

我们在前期研究中，临床上获取了胃癌组织及其癌旁组织样本，采用qRT-PCR检测其表达水平，发现miR-488在胃癌组织中显著低表达。接着通过在线预测软件microRNA.org确定了AREG和相应miR-488结合的靶位点，AREG3'-UTR与miR-488序列间存在特异结合区域，说明AREG是miR-488的靶基因（见研究工作基础）。因此，根据预试验结果和相关文献，我们提出了以下假说：在胃癌细胞中，miR-488下调AREG基因的表达，减少了其与EGFR的结合，从而抑制了ERK通路相关蛋白的表达，导致胃癌血管新生受阻，减少细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，且对化疗敏感性有一定影响（见图3）。生信预测预实验情况2：申报人前期基础较差，且相关的前人研究太少Step5前期实验证据「」回答问题为了解决这些科学问题，我们做了什么前期研究？Step5前期实验证据「」

本课题将在原有工作基础上，在器官、细胞及分子水平上观察青年与老年IR与IPC心肌多胺代谢变化的规律和特点，探讨老龄心肌IR损伤及IPC保护和多胺水平变化的内在联系。观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的影响。通过诱导或阻断自噬（siRNA干扰）和调控线粒体通透转运（开放或抑制mPTP）干预，探讨外源性多胺是否通过诱导自噬/减少线粒体损伤/抑制氧化应激/抗凋亡级联重现老龄心肌IPC保护作用。并进一步细胞、亚细胞水平上探讨多胺发挥作用的准确效应靶点。以上问题的解决将能够验证我们提出的“多胺是介导缺血预适应心肌保护的内源性信号分子、多胺代谢通路可能成为老年心肌缺血/再灌注损伤防治的新靶点”的假说。目前，国内外未见相关报道。本课题的完成，为老龄心肌缺血/再灌注损伤的防治提供一种新思路、新靶点和新的技术平台。具有重要的理论意义和应用价值。

——见附件-案例1

但关于老龄IR与IPC心肌多胺代谢的特点和规律如何？外源性多胺能否恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性？如果能，其机制是什么？以及多胺在老龄IPC心肌保护中作用的准确效应靶点是什么？这些还不清楚，这些是本课题研究的主要内容。Step6概括研究内容「」Tips：大致提出解决方法即可有哪些需进一步探索

本课题将在原有工作基础上，在器官、细胞及分子水平上观察青年与老年IR与IPC心肌多胺代谢变化的规律和特点，探讨老龄心肌IR损伤及IPC保护和多胺水平变化的内在联系。观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的影响。通过诱导或阻断自噬（siRNA干扰）和调控线粒体通透转运（开放或抑制mPTP）干预，探讨外源性多胺是否通过诱导自噬/减少线粒体损伤/抑制氧化应激/抗凋亡级联重现老龄心肌IPC保护作用。并进一步细胞、亚细胞水平上探讨多胺发挥作用的准确效应靶点。以上问题的解决将能够验证我们提出的“多胺是介导缺血预适应心肌保护的内源性信号分子、多胺代谢通路可能成为老年心肌缺血/再灌注损伤防治的新靶点”的假说。目前，国内外未见相关报道。本课题的完成，为老龄心肌缺血/再灌注损伤的防治提供一种新思路、新靶点和新的技术平台。具有重要的理论意义和应用价值。