广西猪群中siv与prrsv、csfv、prv、hps混合感染的调查

广西猪群中siv与prrsv、csfv、prv、hps混合感染的调查

猪感染（sw）是由猪流感病毒（sw）引起的急性呼吸道疾病，传播迅速，通常导致急性呼吸道疾病的暴发。该病一年四季都可发生,但以春秋多发,各种日龄的猪都可感染。临床上主要表现为咳嗽、流鼻涕、呼吸困难、高烧,怀孕母猪有流产的可能。单纯的SIV感染表现为发病率高,死亡率低,然而SIV与猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、2型猪圆环病毒(PCV-2)等引起免疫抑制的病毒混合感染时,会显著增加上述疾病的损害程度和病死率。此外,SIV还是引起“猪高热综合征”的主要病原之一。SIV与其他病原体共感染或继发感染所造成的损害,已成为制约猪场经济效益的主要原因之一。本研究应用套式PCR方法对采自广西境内13个市122个不同规模猪场及农村散养户126份病料进行SIV检测,并对15份鉴定为SIV阳性的病料再分别进行PRRSV、猪瘟病毒(CSFV)、PCV-2、猪伪狂犬病病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HPS)的检测,结果发现广西发病猪群中SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2的混合感染普遍存在。SIV与其它病原混合感染的调查结果为更好地研究“猪高热综合征”的相关病原提供了科学依据。1材料和方法1.1农村散养户病料收集广西境内13个市122个不同规模猪场及农村散养户126份病料,包括病猪肺、淋巴结、脾、肾、脑、胸水等组织,收集时间为2007年1月～7月(2005、2006年各有1份)。1.2抑制剂、taqna聚合酶、dntps、kAMV反转录酶购自Promega公司;RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量标准、蛋白酶K等购自TakaRa公司;Trizol购自Gibco公司。1.3引物的设计合成根据GenBank登录的SIVNP、PRRSVORF7、CSFVE2基因、PCV-2全基因、PRVgD及HPS16SrRNA基因的核苷酸序列,设计合成以下分别用于这6种病原检测的引物(表1)。1.4取精华组织材料1.4.1tri囊l的制备取约1g病猪组织(肺、淋巴结、脾、肾、脑等)于研磨器充分研磨,用Hank’s液1∶5稀释,反复冻融3次,12000r/min离心1min;取上清液300μl,加入500μl的Trizol,混合均匀,室温放置10min,加入160μl氯仿,混匀,室温下放置2～3min,12000r/min4℃离心10min;取上清400μl转移到新的EP管,再加入等量的异丙醇,混匀,室温下放置10min,12000r/min4℃离心10min,弃上清,沉淀用75%乙醇洗涤,在超净台中通风晾干,RNA沉淀溶解于35μl用DEPC处理过的灭菌超纯水中,置-20℃冻存备用。1.4.2样品处理和u3000制备用Hank’s按1∶3比例研磨病料,反复冻融3次后,8000r/min离心5min,取500μl上清,加入50μl10%SDS,20μl蛋白酶K(20mg/ml),55℃水浴消化1h,每15min摇1次;加等体积苯酚,12000r/min离心5min;取上清,加入等体积苯酚、氯仿(按1∶1比例),摇匀,12000r/min离心5min;取上清,加等量氯仿,混匀后12000r/min离心5min;取上清,加入1000μl预冷无水乙醇,再加入1/10体积3mol/L的NaAC;置-20℃沉淀30min,12000r/min离心15min,倾弃上清,用75%乙醇500μl洗涤2次;37℃烘干,加20μl双蒸水溶解,置-20℃保存备用。1.5核电站检测1.5.1pcr扩增条件SIV检测采用套式PCR方法,参照祁贤等(2005)的方法修改进行。第一轮PCR扩增反应体系为25μl,反应成分如下:上下游引物P1/P2各0.5μl、10mmol/LdNTP0.5μl、10×Buffer2.5μl、DNA模板2μl、Taq酶0.3μl(5U/μl),用灭菌双蒸水加至总体积25μl。PCR反应条件:95℃预变性5min;95℃变性30s,64℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;然后72℃延伸10min。第二轮PCR扩增反应成分为:上下游引物P3/P4各0.5μl、10mmol/LdNTP0.5μl、10×Buffer2.5μl、以1μl第一轮PCR扩增产物作为模板、Taq酶0.3μl(5U/μl),用灭菌双蒸水补至总体积25μl。按95℃预变性5min;95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,进行30个循环;然后72℃延伸10min。琼脂糖电泳鉴定,以出现287bp特异条带的样品为阳性。1.5.2常规pcr方法PRRSV、CSFV、PCV-2、PRV、HPS的检测,按常规PCR的方法进行,具体参照娄高明等(2000)、芦银华等(2003)、Grego等(1989)、李学伍等(1996)、Oliveira等(2001)进行。2结果2.1pcr扩增结果运用套式PCR方法,对126份临床组织病料进行检测,结果有15份样品扩增出大约287bp的特异条带(第二轮PCR扩增),与预期结果一致(部分电泳结果见图1)。2.2pcv阳性样品及分布地区检测结果用常规PCR方法对15份SIV阳性样品进行PRRSV、CSFV、PCV-2、PRV和HPS检测,结果8份为PRRSV阳性样品,3份为CSFV阳性样品,8份为PCV-2阳性样品,PRV和HPS没有检出阳性样品(电泳图略),这些样品的检测结果及分布地区均列于表2。2.3混合感染的情况将15份SIV阳性样品同时检测其它5种病原菌的检测结果进行分类整理,结果见表3。从中可以发现临床上单纯的SIV感染仅占26.7%(4/15),其余为混合感染,占73.7%(11/15)。在混合感染中三重感染(SIV+PRRSV+PCV-2、SIV+PRRSV+CSFV)高达40%(6/15),二重感染(SIV+PRRSV,SIV+PCV-2)占26.67%(4/15),最严重的多达到四重感染(SIV+PRRSV+CSFV+PCV-2)。其中又以SIV与PRRSV、PCV-2这2种病毒的混合感染最为严重,均达到53.33%(8/15),CSFV占20%(3/15)。表明猪群中病毒的混合感染十分严重。3siv与prrsv的混合感染本研究检测的病料分别来自广西13个市,几乎遍布广西,因此检测结果具有一定的代表性,基本能够反映广西猪群中SIV的流行现状。从检测的结果看,广西猪群中SIV的混合感染十分严重,其中又以与PRRSV、PCV-2这2种能够引起免疫抑制的病毒的混合感染最为严重。临床上主要表现为体温升高、喘气、咳嗽,断奶前仔猪流鼻涕、精神沉郁、消瘦,部分猪耳朵发绀,有些猪拉黄色浆状粪便,有些猪便秘。剖检主要病理变化为鼻腔和气管内有泡沫状黏液,肺有间质性水肿、出血,全身淋巴结肿大,脾脏边缘梗死,肾脏表面有出血点。因为SIV与其它病原混合感染严重,所以临床症状,尤其是病理变化均表现得十分复杂,很少仅见到单纯的SIV病变。由于病料收集时间为2007年1月～7月,此时正值广西“猪高热综合征”流行高峰期,我们检测发现SIV常与“猪高热综合征”的主要病原—PRRSV变异株(Nsp21594～1680变异株)混合感染,成为引起“猪高热综合征”的病原之一。SIV的存在加重了PRRSV变异株对猪体的损害程度和致死率,这一点从临床上检测有SIV混合感染发病猪的病变及死亡情况就可说明(另文报道)。目前,广西猪群中SIV与其它病毒的混合感染十分严重,在所检测的SIV阳性病料中三重感染(SIV+PRRSV+PCV-2、SIV+PRRSV+CSFV)高达40%,二重感染(SIV+PRRSV,SIV+PCV-2)占26.67%,最严重的多达到四重感染(SIV+PRRSV+CSFV+PCV-2)。应引起高度重视,免疫抑制性病毒的普遍存在,会严重影响疫苗的免疫效果,我们在发生“猪高热综合征”的猪群中调查CSFV免疫抗体产生情况,发现普遍不达标,这也是造成CSFV发病