10.23 生化实验报告 物质代谢试验

物质代谢实验实验十八胰岛素对血糖含量的影响实验十九邻甲苯胺法测定血糖含量【实验原理】胰岛素是调节血糖水平的重要激素，它能增加肌细胞和脂肪细胞对葡萄糖的通透性，促进葡萄糖进入这些细胞，加速葡萄糖的氧化分解，促进糖原合成和转变成其他物质，从而使血糖水平下降。水浴加热到100摄氏度左右时，葡萄糖在浓酸溶液中脱水生成羟甲基呋喃甲醛（羟甲基康醛），此生成物可以与邻甲苯胺缩合成蓝绿色化合物，根据其颜色深浅通过分光度比色法测定其含量。【实验步骤】取兔采血标本分离血清 测定未注射胰岛素时的血糖含量 注射胰岛素 两小时之后采血标本，依照前述步骤测定注射胰岛素之后的血糖含量[邻甲苯胺法测定血糖含量]【实验结果】试剂（ml）测定管测定管（加胰岛素后）标准管空白管血清0.10.1——糖标准——0.1—蒸馏水———0.1邻甲苯胺试剂4.04.04.04.0OD1.1480.3460.6730.000血糖浓度（mmol/L）9.482.860.560.0加入试剂后，混匀，沸水浴加热10min，取出立即置于冷水中冷却。以空白管调零，在630nm波长处测各管吸光度值，并按照下式计算血糖浓度：测定管【结果分析】正常空腹血糖浓度为3.9-5.6mmol/L。此次试验存在较大误差。加入胰岛素后的测定管所得血糖浓度比未加入胰岛素的测定管的血糖浓度低，说明胰岛素是调节血糖水平的胰岛β细胞分泌的一种蛋白类激素。它能增加肌细胞和脂肪细胞膜对葡萄糖的通透性，促进葡萄糖进入这些细胞，加速葡萄糖的氧化分解，促进糖原合成和转变成其他物质，反映到血糖水平上是使血糖水平下降。加入胰岛素后，胰岛素促进了细胞对葡萄糖的利用，加速了葡萄糖的氧化分解和转化为其他物质，并且抑制了非糖物质转化为葡萄糖，从而降低了血糖的浓度，使家兔血糖水平下降。测定管中测得的血糖浓度高出正常值，可能原因有如下几个方面：加入邻苯甲胺试剂不足4.0ml，致使溶液体积减少，血浆浓度增大。或者所取邻苯甲胺溶液不纯，溶液本身浓度偏低。取血浆体积偏大，使溶液混合后血浆浓度偏高。沸水浴加热后，并没有冷却充分，使溶液温度偏高，测得吸光度值偏大。进行吸光度测量时，操作不当，手指触碰比色池使吸光物质增多，吸光度增大。进行吸光度测量时，由于配置溶液体积有限，对比色池润洗不充分，使比色池吸光能力增大，使结果偏大。吸光度值超过1时，测得的吸光度不准确，误差较大。使用比色池过程中有溶液在壁上而未擦净。实验过程中，移液管的量程选取不当，导致实验结果存在误差。实验过程中，洗刷试管后倒立放置可能被污染，移液管倒置，使用吸耳球时出现部分蒸馏水吸进吸耳球，也是实验过程中应该注意和避免的。实验二十糖酵解中间产物的鉴定【实验原理】将酵母液在一定介质中（适宜的pH，必要的金属离子等）进行保温，在酵母液中酶体系的作用下，糖进行酵解反应，当反应进行到生成二分子磷酸丙糖时，加入一碘乙酸可使酶失去活性，酵解反应就停在磷酸丙糖阶段。然后加入硫酸肼保护磷酸丙糖，使磷酸丙糖积累，进而与2，4-二硝基苯肼反应生成苯腙，苯腙在碱性溶液中呈紫红色。pH7.4磷酸盐缓冲液可以为糖酵解提供适宜的pH值和金属离子；一碘乙酸可以使3-磷酸甘油醛脱氢酶失活，酵解反应停留在磷酸丙糖阶段；硫酸肼为稳定剂，使其不发生分解反应；10%三氯乙酸溶液是强酸，可以使糖酵解过程中参与的所有酶都失活，使糖酵解过程停止。第一次加入的1mol/LNaOH溶液可以使磷酸丙糖去磷酸，生成的颜色比较稳定。【实验过程】酵母混悬液制备糖酵解反应记录结果【实验结果】试剂（ml）管号123pH7.4磷酸盐缓冲液2.02.02.0一碘乙酸0.50.5—硫酸肼0.50.5—10%CCl3COOH溶液1.0——酵母液4.04.04.0蒸馏水—1.02.0混匀，在37℃恒温水浴中保温30min一碘乙酸——0.5硫酸肼——0.510%CCl3COOH溶液—1.01.0蒸馏水2.01.0—混匀，静置10分钟，3000r/min，离心10min，再取试管，对号按下表操作123上清液0.50.50.51mol/LNaOH溶液0.50.50.5混匀，室温放置10min2,4-二硝基苯肼0.50.50.51mol/LNaOH溶液3.53.53.5实验结果反应程度不反应半反应全反应颜色深浅较浅最深最浅【结果分析】此次试验比较成功。1、结果分析①1号试管中，三氯乙酸使酵母液失活。但是失活过程需要一定时间，所以有一小部分葡萄糖进行了糖酵解，生成少量磷酸丙糖，与2,4-二硝基苯肼反应显色，颜色较浅。②2号试管中，最初未加入三氯乙酸，酵母液有活性，但是加入了一碘乙酸，使3-磷酸甘油醛脱氢酶失活，使糖酵解反应停留在磷酸丙糖阶段，并加入硫酸肼保护磷酸丙糖，所以磷酸丙糖大量积累，在加入2，4-二硝基苯肼后发生显色反应，颜色最深。③3号试管中，一碘乙酸和三氯乙酸都未加入，糖酵解反应顺利进行，溶液中几乎不含磷酸丙糖，所以在加入2,4-二硝基苯肼后显色反应不明显，颜色最浅。2、误差分析①溶液震荡混合不均匀，且进行实验室只取上层溶液，可能使测定结果偏低。②进行离心操作时，操作不当，使溶液溅出，配平时加入其他溶液，使溶液浓度降低，反应结果偏低，整体颜色不深。③进行离心前的配平过程中，四个试管质量和重心可能有一定偏差，套管中有原本就有的固体和液体杂志，致使离心不充分。另外在离心过程中，多组同学共同进行配平，可能导致离心出现问题。④在震荡过程中可能存在震荡不够均匀以及溶液溅出或者混合的情况。实验二十二血清脂类含量测定【实验原理】胆固醇酯酶（CEH）可以把胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇又在在胆固醇氧化酶（COD）的作用下氧化成Δ4-胆甾烯酮和H2O2。H2O2经过氧化物酶（POD）催化氢与4-氨基安替比林和酚（4-AAP）反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量成正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。【实验结果】加入物测定管标准管空白管血清（μl）10——胆固醇标准液（μl）—10—蒸馏水（μl）——10酶应用液（μl）100010001000吸光度0.3090.2830.000胆固醇浓度（mmol/L）5.645.170.00混匀后，37℃水浴保温15min，在500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。并按照下式计算结果（已知：胆固醇标准液浓度为5.17mmol/L）。CHO【结果分析】血清中胆固醇的正常范围是3.10-5.70mmol/L,测得结果为5.64mmol/L，在正常范围之内，试验较成功，误差较小。测得的胆固醇含量在正常值的上界，可能出现误差的原因：加入的酶应用液较少，使血清浓度相对偏大，测得的结果稍大。吸光度值测量时，对比色池润洗不充分，吸光度值稍大，结果稍大。分组测定吸光度，可能出现不同样本的数据误差。注射枪有损坏，导致可能溶液量取不准。用注射枪注射血清时打到管壁上，可能导致血清的浓度偏低。下次应注意直接打到管底。整体回顾与分析改进部分相对于第一次实验，本组注重了同一试剂由单人负责滴加的