第二十一章 免疫学方法技术

第21章免疫学方法技术第一节

基于Ag-Ab反应的检测方法抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serologicalreaction)用于：抗原（微生物、细胞、激素、细胞因子、肿瘤标志物等）、抗体的检测。特异性抗原抗体反应的可见性适当的比例和浓度可逆性抗原抗体反应的特点应用1、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。（2）检测自身抗体—诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等。2、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原：确认运动员是否服用兴奋剂沉淀反应补体参与反应中和反应2341免疫标记凝集反应2435Ag-Ab反应的基本类型一、凝集反应（agglutinationreaction）概念：细菌、细胞等颗粒性抗原或包被有抗原的颗粒状物质（如聚苯乙烯乳胶等）与相应的抗体结合，出现肉眼可见的凝集团，称为凝集反应。1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。细菌的鉴定和血型的检查检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体二、沉淀反应（precipitation）概念：可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合，形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。在液体中进行出现絮状沉淀，在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。1．单向免疫扩散(singleimmunodiffusion)2．双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion)3．免疫电泳(immunoelectrophoresis)4．免疫比浊(immunonephelometry)

1、单向免疫扩散（singleimmunodiffusion）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。环的直径与抗原含量成正相关2、双向免疫扩散（douleimmunodiffusion）：抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。

1）简易免疫电泳先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线，2）对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术3）火箭免疫电泳(rocketimmunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。4、免疫比浊在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成免疫复合物，液体混浊。用浊度计测量反应体系的浊度，可绘制标准曲线并依据浊度推算样品中抗原含量。三、补体参与的反应溶菌反应细菌与相应Ab结合，可激活补体，使细菌溶解。主要发生于霍乱弧菌等G+菌，可用于细菌鉴定。溶血反应红细胞与相应抗体结合，通过激活补体使红细胞溶解，可作为补体结合试验的指示系统。补体结合反应是一种在补体参与的条件下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来测定有无相应抗原或抗体的血清学试验。第二节免疫标记技术免疫标记技术（Immunolabellingtechnique）概念：用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质未改变抗原抗体的免疫学特性，同时标记物极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶免疫荧光检测法（IFA）放射免疫检测法（RIA）酶免疫检测法（EIA）1．抗体制备。多克隆抗体单克隆抗体，2．标记物与标记方法。放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。免疫分析基本环节3．分析方式设计：

非竞争方式、竞争方式；

直接法、间接法；

标记抗原、标记抗体；

均相、非均相

4.信号检测。

与相应的标记物对应。主要为分光光度法、

荧光光度法、化学发光检测法。

一、免疫荧光法

(immunofluorescence,IF)概念：荧光素标记的抗体（抗原）与组织或细胞中的相应抗原（抗体）结合，借助于荧光显微镜或流式细胞仪对抗原（抗体）进行鉴定或定位。（1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。免疫荧光法分类免疫荧光法图示MousekidneysectionLaminin-green-fluorescentQdot®565IgG

CD31-red-fluorescentQdot®655IgG

Nuclei-blue-fluorescentHoechst33342ControlTSLPTSLP-AlexaFluor®488

Nuclei-propidiumiodide

HASMC

流式细胞术（FlowCytometry,FCM)概念：FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。流式细胞仪的细胞分析原理待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱，进入流动室。被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照时后发出荧光，被荧光光电倍增管接收，实现了细胞的定量分析。再通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现了细胞的分选。流式细胞仪工作原理二、酶免疫测定

(enzymeimmunoassay,EIA)概念：是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。常用的酶为：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酯酶（AP）酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺（OPD）

3、3‘二氨基联苯胺（DAB）

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色360,450

420常用的方法如下：（1）酶联免疫吸附试验测定可溶性抗原或抗体（2）免疫细胞或组织化学测定组织中或细胞表面的抗原1.免疫细胞或免疫组化技术概念：应用酶标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。ICCIHC2.酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)

基本原理：是将过量抗体（抗原）包被于载体（聚苯乙烯微量反应板）上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。ELISA试剂盒1.双抗体夹心法用于检测特异性抗原。方法：将已知抗体吸附于固相载体．加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。2.间接法用于检测特异性抗体。方法：将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。抗原一抗二抗生物素HRP亲合素＋3.竞争法用于抗原和半抗原（抗原决定簇少）的定量测定，也可用于测定抗体。方法：以测定抗原为例．将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。

ELISA反应过程动画演示A.用已知抗原检测分泌性特异性抗体的B细胞B.用抗细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子

4.酶联免疫斑点试验ELlSA方法的技术要点I与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，由于载体不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除载体的理化性质外，受缓冲液的离子强度、pH值、包被时的温度和时间等多种因素的影响。用抗原或抗体包被后。固相载体表面往往尚残留少量未饱和的吸附位点，产生非特异吸附，导致本底偏高。为此．常用1％—5％BSA，或含5％—20％小牛血清的PH9.6碳酸盐缓冲液注满凹孔，37℃作用1h，可以消除此种干扰。这一过程称为封闭(blocking)。固相载体和免疫吸附剂的制备ELlSA方法的技术要点II抗原和抗体用于制备酶标记物和包被固相载体的抗原要求纯度高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强，并具有较高的比活性。如将抗体IgG用木瓜蛋白酶水解为Fab片段，再与酶连接，可以减少非特异性吸附，检测效果更佳。McAb的应用，进一步提高ELISA法的特异性和灵敏度。使用针对抗原分子中不同决定簇的两种McAb分别作为固相抗体和酶标抗体用于双位点夹心法，简化了操作程序。通常采用特异性较高的McAb作为固相包被抗体，与酶标记的多克隆抗体相结合进行检测，结果更为满意。在ELISA法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计(酶标仪)测量光密度值，籍以定量测定样品中待捡抗原或抗体的含量。ELlSA方法的技术要点III常用的酶及其底物辣根过氧化物酶 (HRP)

OPD,TMB碱性磷酸酶 (AP)

PNP半乳糖苷酶 (Gal)

NPG葡萄糖氧化酶 (GOP) PAP三、放射免疫测定法

(Radioimmunoassay,RIA)概念：是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。结合相游离相基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合。

Ag*AbAg标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性示意图RIA法原理及标准曲线

7550301001101001000未标记抗原浓度（ng/ml)结合/未结合的放射活性（%）四、化学发光免疫分析概念：将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。灵敏，无污染，可用于替代