第三章 动物细胞工程制药45节

第四节动物细胞的培养条件和培养基第四节动物细胞的培养条件和培养基为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本条件：（1）绝对无菌操作：所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保证无菌，避免细胞外微生物的污染（2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量的离子掺入（3）适量氧气供应

（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物（5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透压和离子浓度等（6）及时分种，保持合适的细胞密度细胞培养的无菌操作二氧化碳细胞培养箱

第四节动物细胞的培养条件和培养基一、动物细胞的培养条件二、动物细胞培养基的种类和组成一、动物细胞的培养条件1、器材的清洗和消毒细胞培养工作中的清洗和消毒的目的是去除任何影响细胞生长的有害因子，防止外来微生物的污染，这是细胞培养成功与否的重要环节之一，决不能掉以轻心1、器材的清洗和消毒器材的清洗：一般来说，需经浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤，用过的器材最好尽快地浸泡在3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白质和残余细胞等污垢经常使用的玻璃器材不一定每次刷洗完之后都要泡酸，但新买的玻璃器材在使用前必须泡酸（配比表见表3-3）。器材刷洗或清洁液浸泡后都必须用水充分冲洗，再用蒸馏水和无离子水冲洗器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学方法来达到严格无菌的操作过程。书中表3-4是细胞培养中常用的消毒剂、浓度和使用场合的列表。尽量避免使用抗生素，但在工业生产中还是经常使用的。对以在细胞培养中是否可以采用抗生素，说法不一多数人认为采用抗生素弊大于利，因为细菌很快会产生抗药性，以后就很难消除，同时又有人证明，长期使用抗生素，可影响细胞的生理代谢和形态，还会影响细胞内的一些信号通路在实际操作中，尤其是在大规模生产中，为了尽可能避免污染，造成经济损失，有人仍主张采用抗生素，而且用量差别很大，常用抗生素及其浓度见表3-5按规定在生产中不准使用青霉素和β-内酰胺类（革兰式阳性细菌）抗生素，其他抗生素是可以接受的，非生产性的实验不受此规定实验室中常加的是青霉素和链霉素，简称双抗，防细胞污染污染最多的是霉菌和真菌培养器皿动物细胞培养瓶内表面为什么要光滑、无毒？多孔板细胞培养瓶一、动物细胞的培养条件2、水质动物细胞培养对环境中各种因素非常敏感，因此水质的好坏直接影响培养的成功与否微量的有毒元素、过多的金属离子，以及微生物的污染等，都会危害细胞的生长。因此细胞培养的用水必须进行特殊的处理才能使用蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤等单独使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低，电阻值在18M

以上。动物细胞制药用水，要求去热源一、动物细胞的培养条件3、pHpH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透性以及许多蛋白的功能都有重要的影响。动物细胞培养的最适pH为7.2~7.4，低于6.8或高于7.6时会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变甚至死亡。一般来说，传代细胞比原代细胞对pH变动的耐受性强，细胞量多时比细胞量少时耐受性强。细胞代谢也会造成pH变化，可用缓冲体系来稳定细胞周围环境的pH。书中给出了部分缓冲体系，可以参考一、动物细胞的培养条件4、渗透压由于动物细胞缺乏细胞壁，因此外界环境渗透压的高低波动对细胞的存活有很大的影响不同的细胞对渗透压波动的耐受性不同，比如原代细胞较传代细胞敏感通常最理想的渗透压为290～300mOsm/kg，调整渗透压采用的是加减NaCl

的办法。每增加或减少1mg/mL的NaCl可使培养基的渗透压增加或减少32mOsm/kg4、渗透压在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持有较合适的渗透压和pH，一般都需要使用平衡盐溶液（balancedsaltsolution,BSS），它由无机盐和葡萄糖组成。表5-6列出了几种常用平衡盐溶液（BSS）组成/g·L-1。一、动物细胞的培养条件5、温度温度对微生物和动植物细胞的培养都很重要，但细胞种类不同，培养温度要求有所不同动物细胞特别是哺乳动物细胞的最佳培养温度为（37±0.5℃），昆虫细胞则为27℃温度过高可引起细胞衰退甚至死亡，过低则会降低其代谢和生长速度，影响产物的产量一、动物细胞的培养条件6、空气空气也是细胞赖以生存的必要条件之一。尽管细胞在短时期缺氧时可以通过糖酵解途径进行代谢获取能量，但该代谢是不完全的，获得的能力也是有限的，而且还会大量产生乳酸，使pH值急剧下降，最终引起小的退变和死亡。因此在细胞培养中必须给以足够的氧气对于动物细胞来说，它在体内的生存条件一般都低于空气中氧的饱和值的60%，对氧的消耗为0.006～0.3μmol/106细胞·h-1或0.24mg/106细胞·d-16、空气一般采用方瓶或转瓶培养时，只要我们保持瓶内有足够的空间，即培养液体积不超过总体积的30%，通过液面的空气交换，就可以保证细胞有足够的氧，不需要专门通气。但采用生物反应器大规模培养时，则必须专门通气，补充氧量过高的氧对细胞生长也会产生不利的影响，甚至是有毒的。

生产中常采用不同比例的O2,N2,CO2和空气，根据需要加以使用性质微生物细胞动物细胞大小1-10μm10-100μm代谢调节方式内部内部和激素营养要求宽松，可利用多种底物苛刻生长速率倍增时间一般为0.5-2h倍增时间一般为12-60h机械强度较好很差，缺乏保护性细胞壁环境适应好差微生物细胞与动物细胞培养方法的比较

所谓动物细胞培养是将动物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖微生物和动物细胞培养方法的比较微生物细胞动物细胞PH控制添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液搅拌速度速度快、范围广较慢溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度改变进入气体的氧浓度培养基灭菌方法高温蒸煮过滤培养时间几小时—几天几天—3、4周对水纯度的要求较低很高

与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。二、动物细胞培养基的种类和组成细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等天然培养基材料成分复杂、组分不稳定，来源有限，因此不适于大量培养和生产的需要2、合成培养基：1950年Morgan等首先用成分明确的化学试剂配置了第一个合成培养基-199培养基，从而开创了合成培养基的研究使用阶段199培养基除了BSS外，还含有53种成分，添加适量的血清后，可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等优点：是成分明确，组分稳定，可大量生产供应，至今已有几十种商品在市场上供应。动物细胞培养中常用的有BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640以及ISOCOV、199和McCoy等，构成这些培养基的主要成分见书中表3-7BME培养基

BME

：basalmediumEagle(依格尔)

性质：动物细胞培养基，更适用于二倍体或原代哺乳动物细胞培养MEM培养基MEM(低限量基础培养基，minimumessentialmedium

)一种动物细胞培养基，含Earle(依格尔)’s盐和L-谷氨酰胺，含碳酸氢钠，类似于BME培养基，适于支持各种哺乳动物细胞的生长

DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium)

培养基DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，

DMEM细胞培养基是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等

这种培养基的特点：

（1）氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；

（2）维生素含量为依格尔培养基的4倍；

（3）含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；

（4）含有微量的铁离子

该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养;如A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养市售动物细胞合成培养基合成培养基的组成部分（1）氨基酸含细胞生长中所必需的而又不能依靠自身合成的12种必需氨基酸，还有谷氨酸（Glu），Glu几乎是所有细胞重要的碳源和能源商品中合成培养基最少的是13种氨基酸的EagleMEM培养基最多的是21种的199培养基（2）维生素维生素在细胞培养中还起着特殊的作用维生素A对细胞的贴壁有重要的作用维生素C有抗氧化作用胆碱对细胞膜的完整性有重要的作用，缺少时细胞变圆，以致死亡（3）糖类细胞生长依赖于碳源，它是维持细胞生命活动的能量来源主要的碳源是葡萄糖和谷氨酰胺，当使用葡萄糖时，常需要补充丙酮酸钠有的培养基还加入核糖和脱氧核糖，以及乙酸钠等（4）无机盐无机盐的作用是保持细胞的渗透压，缓冲pH的变化，并积极参与细胞的代谢一般合成培养基中加入NaCl、KCl等，用以维持细胞的渗透压和缓冲pH的变化另外，加入CuSO4,ZnSO4等，用以促进细胞的代谢二、动物细胞培养基的种类和组成上述合成培养基中主要有氨基酸、维生素、糖类、无机盐以及其它一些特定成分如核酸的前体腺苷、鸟苷等为了给细胞培养以更大的方便，以便于其增殖或贴附生长，常培养基中加入一定量的动物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，杂交瘤细胞的培养中，血清可能要求的更高，常用10~20%的胎牛血清培养用血清血清的作用机制可能为：（1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各种生长因子和激素

生长因子：胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子

激素：皮质醇、雌二醇、黄体酮、甲状腺素

（2）提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子

贴附和伸展因子：纤维结合蛋白、软骨素、昆布氨酸、胶原（3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白

结合蛋白可与维生素、脂质和激素结合，并将它们带入细胞

铁传递蛋白可结合传递铁离子它们还可以清除某些毒素和金属的毒性作用

（4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素

脂肪酸中有磷脂质、胆固醇和前列腺素E等，它们可能与其他的生长因子相结合后起作用

微量元素中有铜、锌、钴、钼、硒等，它们对酶有激活作用，并可保护自由基对DNA的损害

二、动物细胞培养基的种类和组成3、无血清培养基无血清培养基的优点如下：①提高了细胞培养的可重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响；②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；③供应充足、稳定；④细胞产品容易纯化；⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析缺点：细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便目前已经有市售无血清培养基（书中表3-8所示）。无血清培养基中都是在合成培养基内加入不同种类的添加剂所构成，大致有以下几类：无血清培养基

德国PAN牌CHO细胞无血清培养液PANSERIN604S，培养基不含不明确的溶解产物和任何植物水解产物,不含任何蛋白质。没有任何动物、人类蛋白或多肽，为表达产品的下游处理工作提供极大方便（1）激素和生长因子：激素方面使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用

细胞生长因子方面使用较多的是表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经细胞生长因子等

（2）结合蛋白：最经常被补充的是铁传递蛋白和白蛋白。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白

（3）贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子，除这些因子外，有的还添加维生素A酸和重组的小肽，它可与细胞的受体结合

（4）其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等（5）

酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂无血清培养基的使用方法目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化为了使细胞适应无血清培养，关键是使所培养细胞：

1.处于对数生长中期

2.>90%活细胞率

3.适应时以较高浓度的起始细胞接种

细胞适应无血清培养基的方法1.直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中2.连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些

无血清用水特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一

第五节动物细胞培养的基本方法一、细胞培养的分类

培养细胞的种类：原代培养、传代培养

培养基的不同：液体培养、固体培养

培养容器的方式：静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定化培养第五节动物细胞培养的基本方法二细胞培养的基本技术1细胞分离为了进行细胞培养，首先要从生物体取得细胞，目前获取细胞的方法有两种，离心分离法和消化分离法

1细胞分离①离心分离法：主要用于从含有细胞体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞，一般用800-1000r/min离心5~10min离心速度过高或时间过程，易挤压细胞使之受损伤或死亡

②消化分离：用消化液消化取自生物体的组织块，使组织松散成细胞悬液，再经洗涤、分离得到所需细胞

常用的消化液：胰蛋白酶、EDTA、或胰酶-EDTA联用

其他的消化液：胶原酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶目前常用的消化液配制①1%胰蛋白酶溶液②0.02%EDTA溶液③胰酶-柠檬酸盐溶液④胰酶-EDTA溶液动物细胞的培养过程

幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础

胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？为什么不用胃蛋白酶动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养

思考讨论：在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？

胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高2细胞计数：细胞分离制备成悬液，准备接种时需进行细胞计数另外，在观察细胞生长变化时，以及观察药物对细胞的抑制作用时，也都要反复进行细胞计数

细胞计数方法：①自动细胞计数器计数：

原理：让一定体积的细胞悬液流经一小孔，并在两个电极之间通过，此时通过的细胞就会对电极间的电流产生干扰而使得电压发生变化，这样就在电子计数器上形成一个信号被记录下来

特点：电子细胞自动计数器，计数速度快，但无法分辨死、活细胞，还会误将细胞结团当做单个细胞记录下来，使计算结果偏低全自动细胞计数分析仪电子细胞自动计数器，计数速度快，但无法分辨死、活细胞②血球计数板计数：最常用，最经济的计数方法具体做法：……………….计数时细胞染色，可分辨死、活细胞

血细胞计数板计数时细胞染色，可分辨死、活细胞结果分析细胞密度

细胞数/ml＝（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数细胞存活百分率细胞活力（％）＝未着色细胞数÷总细胞数×100％a台盼蓝染色：台盼蓝（TrypanBlue，也称Directblue14）一种死细胞染色用色素

化学名：

3,3’-{[3,3’-二甲基-(1,1’-二苯基)-4,4’-二基]双(偶氮)}-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸)，四钠盐

分子式：C34H24N6Na4O14S4

分子量：960.81

外观：黑褐色结晶粉末

摩尔吸光度：>69,000(在606nm附近)

染色原理：

细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可

台盼蓝染色的一些注意事项：1.台盼蓝对人体有毒

2.台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数3.台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰b苯胺黑染色俗称阿尼林黑或精元。一种直接在棉织物上生成的、不溶于普通溶剂的黑色染料染色时细胞悬液与染液比例同台盼蓝，稍放置后即可镜检③结晶紫染色细胞核计数：原理：结晶紫具有低渗，并有鳌合钙离子的作用，因此可以使细胞分散解离和破碎，细胞核染成蓝色该法最经常使用于微载体细胞培养中④四氮唑盐（MTT）染色计数法原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶性的蓝紫色结晶物，并沉积于细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS等均能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪，在490nm波长处测定其光吸收值（OD），可间接反映活细胞数量。在一定细胞数值范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。此法已广泛用于生物活性因子的活性检测、细胞毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测定等3细胞培养时活细胞的观察检测①活细胞的观察检测方法肉眼观察相差显微镜观察

细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄、是否更换等。

细胞常规检查的方法为：肉眼观察一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和