第六章-体外标记免疫分析

核医学核医学第六章体外标记免疫分析体外标记在核医学中的地位体内诊断：脏器显像

功能测定诊断

体外诊断：放射分析临床核医学治疗：131I治疗甲亢核医学实验核医学：利用核技术探索生命现象的本质和物质变化规律体外标记免疫分析

体外标记免疫分析是一门综合性学科，也是一门边缘学科。是集基础医学、实验医学及临床应用于一体的学科。在当前的各种免疫诊断技术中，标记免疫分析是最活跃、发展最快的一个领域。体外标记免疫分析概念：

是利用放射分析方法或其派生的相关非放射分析技术测定生物样品中微量生物活性物质含量的一类分析方法。体外标记免疫分析特点：

利用抗原－抗体结合反应的特异性，加上各种标记物（标记抗原或抗体）的可测量性来达到方便敏感地检测各种体内微量生物活性物质，包括内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等。体外标记免疫分析鼻祖:

(Yalow,July19,1921–)

美国科学家Yalow和Berson。于1956年创建的放射免疫分析(RIA)，测定人血浆胰岛素获得成功。树立了超微量物质体外标记免疫分析的里程碑。1968年，Miles和Hales建立了免疫放射分析(IRMA)。体外标记免疫分析获奖:在1977年Yalow和Berson因创建了放射免疫分析，使微量物质的测定成为可能，而荣获诺贝尔生物医学奖。体外标记免疫分析贡献:

随着基础医学和相关技术的发展，在RIA标记抗原竞争性抑制结合、IRMA标记抗体非竞争性结合的理论基础上，相继派生出许多其它的标记免疫分析方法，如酶标记免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析等多种形式、多种反应模式的综合性标记免疫分析体系，并广泛应用于基础医学、临床医学、教学及科研诸多领域，有力地推动了医学科学的发展。体外标记免疫分析

发展:

电化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析化学发光标记免疫分析

时间分辨荧光免疫分析酶标记免疫分析

放射受体分析

免疫放射分析

放射免疫分析体外标记免疫分析竞争放射结合分析：标记抗原，抗体限量非竞争放射结合分析：标记抗体，抗体过量分类第一节体外标记免疫分析的基本原理体外标记免疫分析基本原理:非竞争性(标记抗体)IRMA体外标记免疫分析竞争性(标记抗原)RIA放射免疫分析（RIA）原理放射免疫技术是标记抗原与未标抗原竞争有限量的抗体，然后通过测定标记抗原抗体复合物中放射性强度的改变，测定出未标记抗原量。放射免疫分析（RIA）原理

Ag待测抗原+*Ag+Ab*AgAb+*Ag(标记抗原)(特异性抗体)(标记抗原抗体复合物)(游离的标记抗原)

AgAb+Ag

抗原抗体复合物放射免疫分析（RIA）原理标记抗原(*Ag)和非标记原(Ag)与限量抗体(Ab)竞争结合。*Ag和Ag具有相同的与Ab结合的能力RIA(竞争结合反应)原理示意图AgAg*AbCFAg*BFB/F１.*Ag:定量、足量２.Ab:限量、特异３.*Ag和Ag具有相同的免疫活性４.Ag+*Ag>Ab的有效结合位点５.*Ag和Ag通过竞争的方式与Ab结合，随着Ag增加，*Ag与Ab结合形成的*AgAb复合物的量减少放射免疫分析（RIA）实验操作步骤：加样（Ag，*Ag，Ab)→混匀，温育（反应达到平衡）→分离→测量→数据处理，质量控制测量测量复合物计数示意图：

光子(射线能)与闪烁体的作用↓闪烁体(光脉冲、光能)↓光电倍增管(电能)↓前置放大器(电脉冲)↓电子探测仪

（计数单位是探测器输出的电脉冲数，CPM或CPS）RIA(竞争性结合)标准品剂量反应曲线依所测得的复合物的放射性计数(CPM)，对比标准品剂量反应曲线，求知待测品的含量免疫放射分析(IRMA)原理单位点：

Ag+*Ab(Ag-*Ab)+*Ab抗原（待测）标记抗体抗原标记抗体复合物双位点：Ad-Ag+*AbAd-Ag-*Ab

固体抗体-抗原（待测）标记抗体固体抗体-抗原-标记抗体复合物IRMA(非竟争结合)反应原理IRMA(非竟争结合)剂量反应曲线RIA＆IRMA的区别第二节体外标记免疫分析的基本试剂和基本技术基本试剂和基本技术１.标准品、质控品２.特异性抗体３.示踪剂(标记品)４.分离技术１.标准品(1)化学结构:应与待测物具有相同的化学结构(2)化学纯度：高度纯化(3)化学度量：准确(4)稳定性：不易变质、不易降解２.特异性抗体(1)亲和力大(2)高滴度(3)特异性强(4)可长期保存３.示踪剂（标记品）

（1）高比活度（2）生物活性与免疫活性与标记前一致（3）化学纯度>95%（4）稳定性好：标记品不易脱落４.分离技术---要求(1)结合部分与游离部分尽可能完全分开(2)非特异性结合率（NSB%）低，小于5%(3)分离的成分便于测量(4)分离效果不受外界环境影响(5)分离试剂操作简便、价廉易得微孔滤膜法盐析法活性炭吸附法磁化颗粒法双抗体法固相分离法分离方法

第三节体外标记免疫分析的类型体外标记免疫分析的类型体外标记免疫分析放射性核素标记免疫分析(RIA、IRMA)酶标记免疫分析发光标记免疫分析(化学发光标记免疫分析化学发光酶免疫分析电化学发光免疫分析)时间分辩荧光免疫分析放射性核素标记免疫分析概念：一种将放射性核素测量的高灵敏性、高精确性和抗原抗体反应的高特异性相结合的体外测定超微量（10-9～10-15g）物质的新技术。放射性核素标记免疫分析分类:竞争性(标记抗原,抗体限量)RIA非竞争性(标记抗体,抗体过量)IRMA放射性核素标记放射性核素标记免疫分析

优缺点：

自1959年Yalow和Berson创建的放射免疫分析（RIA）具有灵敏度高、特异性强、简便实用、成本低廉等优点。为生物医学的微量物质分析开创了新的领域。发展到目前为止由此衍生出了各种各样的标记免疫分析技术。虽然RIA仍有较广泛的使用市场和价值，但其方法学上固有的弱点使发展受到一定限制。如必须使用放射性同位素作为标记物，存在人为的因素影响较大、辐射防护及防止污染的问题，试剂盒使用时间短，可测量范围相对较窄，难以实现操作及测量的自动化等。酶标记免疫分析（EIA）概念：是应用酶标记抗体（抗原）与抗原（抗体）产生特异性反应，根据酶对底物的显色反应而定量分析待测抗原或抗体含量。分类:均相EIA：酶增强免疫分析（EMIT）非均相EIA:酶联免疫吸附分析法（ELASA）时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)概念：是应用镧系元素标记抗原或抗体，利用紫外线或激光使其发射荧光，结合波长和时间两种分辨技术的微量分析方法。常用镧系元素：铕、铽、钐、镝特点：分析范围宽灵敏度高专一度高稳定性强1234发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析（CLIA）电化学发光免疫分析(ECLIA)化学发光酶免疫分析(CLEIA)分类化学发光标记免疫分析（CLIA）

化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法。化学发光免疫分析是将化学发光系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带吖啶酯标记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后---夹心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入碱（pH>10）化学发光标记免疫分析（CLIA）概念：