第四章、第二讲

第四章、第二讲

4.3发酵工业的无菌技术4.4发酵培养基及设备管道灭菌4.3发酵工业的无菌技术干热灭菌法湿热灭菌法射线灭菌法化学药剂灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法

培养基灭菌的有关理论——湿热灭菌原理4.4发酵培养基及设备管道灭菌（一）加热灭菌原理1、微生物的热阻

每一种微生物都有一定的生长温度范围；

当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。

微生物相对热阻大肠杆菌1细菌芽孢3×106霉菌孢子2-10病毒及噬菌体1-5某些微生物对湿热的相对热阻（与大肠杆菌比较）不同种类微生物对热的抵抗力不同。微生物对热的抵抗力称为热阻（heatresistance）。下面介绍与热阻相关的几个概念1）致死温度（Deathtemperature）——杀死微生物的极限温度称为致死温度。2）热力致死时间(ThermalDeathTime;TDT)——在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物所需的最短时间。e.g伤寒杆菌58℃30min变形杆菌55℃60min2、微生物的热死规律——对数残留定律

微生物的热死是指微生物的受热失活，但物理性质不变。

微生物虽然是一复杂的高分子体系，但受热死亡是由于蛋白质变性所致。

在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。对数残留定律的概念：

数学表达式：-dN/d=NN——培养基中活的微生物个数；

——时间（s）;

——比死亡速率（s-1）(死亡速率常数)dN/d——微生物的瞬间变化率，即死亡速率——对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。

若开始灭菌（=0）时，培养基中活的微生物数为N0

=2.303logN0/N/

-dN/d=NlnN/N0=-

积分2.303logN0/N=

or

=2.303lgN0/N/

可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和

值◆

在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。◆

灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N=0，则为∞，上式无意义，事实上也不可能。

一般取N=0.001，即1000次灭菌中有1次失败。例：

有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每ml有2×105个耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速度常数为1.8min－1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)N=0.001;=1.8(min－1)

=2.303

lgN0N=2.3031.8lg(8×1015)=20.34(min)3、死亡速率常数

（比死亡速率）◆

死亡速率常数是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。◆

相同温度下，值越小，则此微生物越耐热。

在121℃，细菌芽孢的值约为1min-1,而营养细胞的值为10-1010min-1。细菌芽孢名称

值min-1枯草芽孢杆菌FS5230硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518硬脂嗜热芽孢杆菌FS617产气梭状芽孢杆菌PA36793.8-2.60.772.91.8121℃某些细菌芽孢的值4、培养基灭菌温度的选择◆培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。◆培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。◆

灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残留定律表达式可知）。◆

在其它条件不变时，比死亡速率

与温度的关系可用阿仑尼乌斯方程式表示。SvanteAugustArrhenius

wasaSwedishphysicalchemistbestknownforhistheorythatelectrolytes,certainsubstancesthatdissolveinwatertoyieldasolutionthatconductselectricity,areseparated,ordissociated,intoelectricallychargedparticles,orions,evenwhenthereisnocurrentflowingthroughthesolution.In1903hewasawardedtheNobelPrizeforChemistry.=AeRTE－—ArrheniusequationA—比例常数；E—杀死细菌所需的活化能，(

E)（×4.18J/mol）;T—绝对温度，(K)R—气体常数，[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)=AeRTE－—lg=———+lgA－E2.303RT以lg对1/T作图，得一直线，其斜率为-E/2.303R，截距为lgA，从斜率和截距科求得A和E值。1/Tlg

截距=lgA斜率=－E/2.303R培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：-dC/d=′CC—对热不稳定物质的浓度,(mol/L);′—分解速率常数（s－1）；—分解反应时间（s）′随反应物质种类和温度不同在化学反应中，其他条件不变，′和温度的关系也可用阿仑尼乌斯方程表示：

′=A′eRTE′－—A′—比例常数；E′—分解活化能，(

E′)（×4.18J/mol）;T—绝对温度，(K)R—气体常数，[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)

1=AeRT1E－—

2=Ae－—ERT2相除取对数ln

2

1=E11RT1T2－〔〕在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数和培养基成分破坏速率常数′都变化。温度由T1升高到T2，值分别为：同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：ln

2′

1′=〔〕RT1T2E′11ln(

2

/1)ln(

2′

/1′)＝EE′上面两式相除，得由于灭菌的E大于培养基成分分解的E′名称E(J/mol)叶酸泛酸维生素B12维生素B1嗜热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌肉毒梭菌70.387.996.792.1283318343因此ln

2/1＞ln2′/1′

即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。

根据这一理论，培养基灭菌采用高温短时间的方法，有利于减少营养成分的破坏。

灭菌温度/℃灭菌时间/min维生素B1破坏量/%10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.01＜1（二）影响培养基灭菌的主要因素1、微生物热阻（前述）2、pH◆微生物在pH6.0～8.0范围内耐热性最大◆pH低于6.0时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，则所需的杀菌时间愈短。影响培养基灭菌的主要因素（continued）

温度孢子数灭菌时间(min)(℃)(个/ml)pH=6.15.35.04.74.51201000087533

11510000252516131311010000706535302410010000740720180150150

pH对灭菌时间的影响影响培养基灭菌的主要因素（continued）3、菌的浓度浓度越高，所需灭菌时间越长例如：如肉毒梭状芽孢杆菌，在105℃湿热灭菌时间芽孢杆菌数/ml时间(min)

9×108489×106369×104209×1021492影响培养基灭菌的主要因素（continued）4、培养基成分◆

油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性

因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的传入。◆

而高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性影响培养基灭菌的主要因素（continued）5、泡沫

泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物；易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。6、颗粒

颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。影响培养基灭菌的主要因素（continued）三、分批灭菌（实罐灭菌）（一）操作1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。

若已先行空罐灭菌，此步可不进行2、预热向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70℃左右。作用：利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音有的工厂省却此步；需通过试验掌握冷凝水的生成量，确保培养基的浓度。3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。4、罐压达1kg/cm2(0.1MPa)时，按装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。升温阶段5、保温调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。保温阶段6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压降温阶段ABCD升温保温降温小型罐升降温快，可忽略；但大型罐不可忽视℃min（二）灭菌时间的计算V=V加热+V维持+V冷却

RT2(E–2RT)V加热=————————·t加热(T-T0)E2

RT2(E–2RT)V冷却=————————·t冷却(T-T0)E2R：气体常数；=1.986[卡/克分子·K]E：耐热孢子致死的活化能；=65000[卡/克分子]T：灭菌维持温度；121℃（393K）T0：开始计算灭菌效果的温度；100℃（373K）例：1）小型发酵罐在120℃灭菌维持15分钟，由100℃（100℃以下灭菌效果不计）加热至120℃的时间为5分钟，由120℃冷却到100℃的时间为3分钟，计算总的灭菌时间。

1.986×3932(65000–2×1.986×393)V加热=————————————————×5=1.15(393-373)×650002

1.986×3932(65000–2×1.986×393)V冷却=————————————————×5=0.69(393-373)×650002V=V加热+V维持+V冷却=1.15+15+0.69=16.6(min)例２）

如果灭菌条件不变，大罐由１００℃加热到１２０℃需２４分钟；冷却至１００℃的时间为１６分钟；求大罐的维持时间。

1.986×3932(65000–1.986×393)V加热＋V冷却=————————————————×（２４＋１６）(393-373)×650002

＝９.２min则大罐维持时间V维持=V－（V加热＋V冷却）＝16.6–9.2=7.4min在不同规模的发酵罐中达到同样灭菌效果所需时间发酵罐规模（升）１２０℃维持时间（分）20017.550012.6500011.3500008.8（三）分批灭菌的优缺点优点：●

不需专门的灭菌设备，投资少、设备简单