第五章植物人工繁殖

第5章植物人工繁殖☆概念

它是为了克服自然有性生殖的不足，满足对优良植物大量的需要，通过组织培养、人工种子、胚胎培养等方法实现植物的快速繁殖。一植物人工繁殖☆植物无性繁殖过程中植株再生的发生方式：1、不定芽型：选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导腋芽萌发成苗。技术关键是打破顶端优势，促进腋芽增殖并促其生根。特点（1）繁殖率高；（2）能保持植物的遗传稳定性；（3）可缩短林木的繁殖周期。

2、器官型：直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽，或者从带芽休眠器官上再生植株。技术关键是要求较高的培养基，需控制激素浓度，避免愈伤组织发生。特点（1）繁殖率非常高，但繁殖速度慢；（2）遗传稳定。3、器官发生型：外植体诱导形成愈伤组织，再诱导生根或生芽再生植株。特点（1）繁殖速度快；（2）遗传性不稳定，易产生变异。4、胚状体发生型：外植体诱导形成胚状体再生植株。技术关键是提高不同外植体的胚状体发生及萌发率，提高胚状体的同步化率。特点（1）繁殖速度快，繁殖率高；（2）遗传性稳定。5、圆球茎型：外植体诱导形成圆球茎，再直接再生植株。圆球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。二、植物组织培养在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。非试管的微组织快繁和试管组织培养。（一）、发展史

1902年，德国植物学家哈伯兰特（G.Haberlandt）最早进行植物细胞培养的试验，被誉为“植物组织培养之父”；1904年，hanning，在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚,最先将幼胚培养技术应用于育种实践的植物细胞工程。1922年，美国、德国分别报导了离体根尖的培养；1934—1939年，先后发现了各种生长素，并利用番茄、胡萝卜的离体培养，初步建立起较为成熟的细胞培养方法，使植物细胞培养进入一个崭新的时代；

1941.荷兰j.vanoverbeek证明椰子乳汁的活性成分可在体外促进其他种类细胞的分裂和生长。1943年，美国怀特（White）提出植物细胞具有全能性1948.中国植物生理学家崔徵和美国科学家合作发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。1954.skoog发现DNA降解物中含有细胞分裂和生长的活性物质。后被命名为激动素。50年代主要在培养方法方面做了一系列卓有成效的工作，使细胞培养技术日臻成熟；White、Gautheret、Nobecourt

等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。

在此基础上建立了植物组织培养的综合培养基，包括无机盐成分、有机成分和生长刺激因素。这是随后创立的各种培养基的基础，同时也建立了植物组织培养的基本方法，成为当今各种植物组织培养的技术基础1960年，Morel提出了利用茎尖离体快速繁殖兰花的方法，在此基础上，国际上建立了兰花工业，取得了巨大的经济效益和社会效益。

1971年，Takebe

等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。

1972年，Carlson

等通过两个烟草物种原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。1973年，Nitch采用花药预培养的方法，首次获得了烟草花粉植株。

1978年，Melchers进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了第一个属间杂种植株

到目前为止，组织培养、原生质体培养、细胞融合已在许多植物上获得再生成功。

（二）、植物组织培养的理论基础

1、植物的无性繁殖被子植物的两种繁殖方式：有性繁殖和无性繁殖。无性繁殖特点：A、不发生遗传重组，后代与亲代在遗传上完全一致；B、可短期内获得大量后代；C、繁殖方式多样化：营养器官再生、营养器官变态、落地生根等2、细胞的全能性

生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全能性。表现全能性的基础和条件基础：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传信息，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。条件：离体，提供营养物质，激素，其他适宜条件（如温度等）在高等动物中，受精卵细胞、早期卵裂细胞、囊胚期细胞具有全能性几乎所有植物的体细胞，雌、雄配子体都具有全能性，都能发育成胚和植株受精卵>生殖细胞>体细胞植物细胞全能性的差异：根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织>居间分生组织>侧生分生组织>薄壁组织(基本组织)>厚角组织>输导组织>厚壁组织。

在生物体内，由于基因的选择性表达，细胞不能表现出全能性，而是分化成为不同的组织器官。当已分化的植物器官、组织或细胞脱离母体后，在一定的营养物质、激素等外界条件作用下分化形成愈伤组织（一种相对没有分化的细胞团），继而在植物激素等诱导下发生再分化，才能表达出全能性，发育成完整植株。3、植物细胞的脱分化和再分化（1）细胞分化细胞分化细胞分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。它包括：时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。细胞分化是一个复杂的生物化学过程，有复杂的调控机制。营养物质和激素的种类和配比能深刻影响分化过程，光照则是许多细胞分化的必需条件细胞的脱分化脱分化：离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程就是细胞脱分化愈伤组织是细胞脱分化的结果已经脱分化的细胞或组织在一定条件下，它们又可以经过胚状体(由体细胞形成的类似合子胚的结构)或愈伤组织再分化出芽和根，从而发育成一个完整的植株。激素则是在一定条件下能打破操纵基因的控制，使结构基因活化。因此，它直接影响和控制细胞的分化。（2）细胞的再分化和器官发生再分化：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件（离体培养）下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整生物体，这一过程称为细胞再分化。切取接种愈伤组织的形成分化形成小芽或根试管苗的形成移栽

成熟细胞分生细胞愈伤组织器官发生胚状体发生再生植株→→↗↘→→脱分化分裂→再分化高等植物细胞脱分化与再分化示意图（3）植物组织再分化的两条途径，一是由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），形成一个完整的植株，因为芽和根都是植物体的器官，所以这一过程叫器官发生途径。另一个是在愈伤组织中产生出一些与种子胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似，所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。（4）几个重要概念

外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。

分化〔differentiation〕：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。

脱分化〔dedifferentiation〕:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。

再分化〔redifferentiation〕:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。

愈伤组织〔callus〕:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。

胚状体〔embroid在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。

继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。

（5）影响植物细胞脱分化和再分化因素：内部因子：植物的遗传性状、生理状况。外部因子：营养条件（植物激素、无机盐、有机营养成分等）、环境条件（培养基的ph、渗透压、温度、湿度、光照等）。不同程度的影响植物细胞脱分化、再分化及器官建成的各个过程。细胞分裂素生长素根分化芽分化愈伤组织愈伤组织再分化过程应先诱导生芽，再诱导生根当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。

植物生长物质的添加量生长素(mg/L)330.030细胞分裂素0.20.0210.2

(mg/L)其它影响植物细胞脱分化与再分化的条件物理因素：切割造成的机械和生理隔离，切割创伤产生的物质。化学因素：化学试剂，辐射处理。（三）植物组织培养程序

利用植物组织培养技术可研究被培养部分（外植体）在不受植物其它部分干扰下的生长和分化规律，并可以用各种培养条件影响它们的生长和分化，以解决理论和生产中的问题植物组织培养条件：含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。1实验材料的清洗和消毒（1）清洗实验材料必须严格清洗，清洗过程勿伤实验材料。（2）消毒清洗药剂灭菌法适用于培养材料的表面消毒。外植体在接种之前，须经严格地灭菌。由于灭菌剂的种类不同，杀菌力不同，因此选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，且不会损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长。在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间。对一些特殊生物特性的植物材料需要特殊的处理。表面具较厚蜡质和角质层的，灭菌剂不易粘着，可加入少量表面活性剂。对器官外植体的灭菌，一般采用多种药剂配合使用的方法。不同器官的灭菌顺序

(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗---70%酒精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次---Naclo或升汞溶液泡10-15min---无菌水洗3-4次（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---无菌水2-3次---取出种子培养（3）根及地下部器官的消毒：自来水冲洗---纯酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---无菌水洗3次（4）花药的消毒：70%酒精浸泡数秒钟---无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次.

一般情况下，如果外植体较大而且硬，可直接用消毒剂处理，如果实、叶片、茎段、种子等的消毒；如果是幼嫩的茎尖，一般先取较大的茎尖，表面消毒后，再在无菌条件下借助解剖显微镜取出需要的茎尖培养；如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、花药等，一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒，再在无菌条件下剥出需要的外植体；如果是细胞，应按培养目的，选择合适的起始材料进行相应的外植体消毒。如果外植体表面污染严重，需流水冲洗1h或更长时间，或者先通过种子培养得到无菌种苗，然后再用其它各个部分建立组织培养。2培养基培养基是植物细胞、组织和器官离体培养所需的营养基质，其中含有植物细胞生长分化所必需的各种营养成分和生长调节物质。培养基成分的筛选和优化是植物组织培养中非常重要的步骤培养基的组成

除了C、H、O之外，需要量比较多的元素叫大量元素，每升几十至几千毫克，包括N,

P,

K,

Ca,

Mg,

S。需要量比较少的元素叫微量营养元素，包括Fe、Cu、Zn、B、

Mo、Mn、Co，Cl。

植物所需的微量元素有其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。

（1）无机营养成分

（2）有机化合物

有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物质和一些其它的有机添加物

*维生素类物质

硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素；而盐酸吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（VB3，又称维生素PP）促进胚的发育；常用的还有VB5、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc），Vc等。

*AA类物质

常用的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。

*糖类

糖在培养基的作用：为细胞提供合成新物质的碳骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物和能量，维持渗透压。

蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。

*其它有机物质

肌醇（环己六醇）

肌醇可以形成果胶物质，利于胚和芽的形成

天然有机物

椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。

（3）植物生长调节物质

无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。

A、生长素类：

吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、

IBA（吲哚丁酸）

、IPA（吲哚丙酸）萘酸类：

NAA（萘乙酸）

苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（

2,4,5-三氯苯氧乙酸）、

2,4,5-TP（

2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。

生长素的生理作用

1）、促进细胞生长和细胞分裂

2）、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力

3）、形成愈伤组织，促进生根

4）、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。B、细胞分裂素类

是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（

6-糠基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—苄基氨基嘌呤。

细胞分裂素类功能：

1）、促进细胞的分裂和分化

2）、诱导芽的分化

3）、促进侧芽的萌发和生长

4）、抑制衰老

C、赤霉素（GA3）

D、脱落酸（ABA）

（4）固化剂和悬浮剂

A、固化剂

琼脂、琼脂糖，琼脂的用量一般在4-10g/L，所购回的琼脂要先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。

B悬浮剂

Ficoll（聚蔗糖）

（5）ph值灭菌之前培养基的ph值一般都要调节到5.0—6.0。一般说来：ph高于6时，培养基会变硬；ph低于5时，琼脂不能很好的凝固。为稳定ph值，往往加入ph缓冲剂（mes等）3、培养基的选择（1）基础培养基：MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养，豆科多用B5培养基。

（2）植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总体原则-当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。

（3）有机成分要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加4、培养基的配制最简单方法是用市售培养基干粉，其中含有无机盐、维生素、和氨基酸。把这种干粉溶解在蒸馏水里（比培养基的最终容积少10%），加上琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终容积，调节ph，高压灭菌，制成所需的培养基。1.按照配方规定的数量称量出各种成分，分别使之溶解于水，然后混合。2.先配制出一系列浓缩储存液，包括大量元素（浓缩20倍）、微量元素（浓缩200倍）、铁盐（浓缩200倍）、和蔗糖之外的有机物质（浓缩200倍），然后彼此混合。注意每种成分分别溶解，一粒不剩。制备储存液和培养基的时候，应使用蒸馏水或无离子水，以及高纯度的化学试剂。制备过程全部步骤：称取规定数量的琼脂和蔗糖，加水至培养基最终容积的3/4。加热溶解；分别加入各种储存液，包括生长调节物质和其他特殊补加物；加蒸馏水至培养基的最终容积；混合后调节ph；分装培养基；用棉塞封口；高压灭菌；培养基室温冷却，至4℃冰箱中保存。5、接种接种是经过表面灭菌的实验材料，按照不同的要求，移至培养基上培养的过程。接种过程必须严格进行无菌操作一防止杂菌污染。接种的操作步骤1)玻璃瓶中放置植物组织块。消毒液消毒。需摇动玻璃瓶2-3次2)无菌蒸馏水清洗，3-4次3)取出材料置于无菌培养皿。4)进行1)时，消毒所要使用器械。蘸入70%酒精，取出火焰灼烧，冷却后可用，每次使用后消毒一次。5)用消毒后的器械切取适当外植体。6)接种外植体于培养基上，移入培养室培养。污染的预防1)接种室要经常灭菌。2)超净台使用前要70%酒精消毒或紫外照射灭菌。每次操作前所有物品先放入台内，勿中途拿入。台面放置东西不宜太多。3)操作人员接种前需肥皂水洗手，穿干净工作服，70%擦手和台面。接种器械70%酒精浸泡，火焰灼烧灭菌。操作时禁止讲话。4)接种打开包头纸时不要污染瓶口。三、体细胞胚胎发生与人工种子（一）体细胞胚胎发生愈伤组织原来是指植物受损伤时在愈合伤口处长出的一团瘤状突起，突起内的细胞已发生脱分化的变化。培养中的愈伤组织是指从外植体的内部或切口表面形成的一团没有分化的均匀一致、无序生长的薄壁细胞团。这种组织具有再分化的能力。1、愈伤组织的诱导

愈伤组织的形成大致要经过起动期、分裂期和形成期三个阶段。1）起动期当外植体已分化的活细胞在外源植物生长物质的作用下，通过脱分化起动而进入分裂时期，进而形成愈伤组织。此期的细胞大小无明显变化，胞内RNA含量迅速明显增加，细胞核变大。2）分裂期是指细胞通过一分为二的方式不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始细胞分裂，使细胞脱分化。此期细胞分裂快、结构疏松、缺少组织结构。3）形成期是指外植体细胞经过诱导、分裂形成了无序结构的愈伤组织时期。此期细胞大而不规则、高度液泡化、无次生细胞壁和胞间连丝，整个组织结构较松散；表面以下约5~10个细胞是细胞生长的中心，分生中心的细胞明显小些，出现了胞间连丝和果胶质，这些中心是愈伤组织的主要生长部位。2、愈伤组织器官的发生愈伤组织在某些条件下可以通过器官发生的再分化途径产生不定芽和根或胚状体，然后再发育成苗或完整的小植株。A不定芽方式不定芽方式是指愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株。这是愈伤组织培养中常见的器官发生方式。愈伤组织通过不定芽方式再分化形成再生植株的方式主要有四种。愈伤组织上分别形成无根的芽或无芽的根；愈伤组织上先形成芽，待芽伸长后再在其茎的基部形成根；愈伤组织上先形成根，再在根基部分化形成芽；先愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后两者接形成植株。B胚状体形成的方式

胚状体形成是指从培养的组织或细胞中直接或间接形成胚胎的生长方式。直接形成胚胎是指在外植体上直接分化出胚状体；间接形成胚是指在外植体上先分化出胚性愈伤组织，然后由胚性愈伤组织再分化形成胚状体。（二）、人工种子人工种子是指植物离体培养产生的体细胞胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中，在适宜条件下发芽出苗。人工种子包括：1）体细胞胚是最里面一层；2）人工胚乳是中间层，含有培养物（即胚状体）所需的营养成分和某些植物激素；3）人工种皮是最外一层为有机的薄膜包裹，以保护水分免于丧失和防止外部物理力量的冲击。图15.3人工种子的结构1、人工种子的制备A、体细胞胚的制备体细胞胚的发生方式体细胞胚胎（胚状体）可由表皮细胞、愈伤组织、悬浮细胞、花粉、原生质体等发生：1）来源于外植体的表皮细胞，如石龙芮、刺五加、芹菜等；2）来源于愈伤组织细胞，如玉米、西洋参桃等；3）悬浮培养中由单细胞来源的胚状体，如胡萝卜、芹菜等；4）由花药花粉培养产生的单倍体胚状体，如曼陀罗、烟草、青椒等；5）来源于原生质体的胚状体，如玉米、黄瓜。体细胞胚胎发生的同步控制在培养中体细胞胚胎的发生一般是不同步的。控制胚状体的同步发育是人工种子的重要条件。现在常用以下几种方法对体细胞胚的发生进行同步控制。1）同步脱分化促进细胞的同步分裂细胞培养初期加入DNA合成抑制剂（如五氨基脲嘧啶），使细胞DNA合成暂时停止。一旦除去DNA抑制剂，细胞开始进入同步分裂。2）不同的温度处理低温处理抑制细胞分裂，然后再把温度提高到正常培养温度，也能使胚性细胞达到同步分裂的目的。3）利用渗透压控制胚的同步生长不同发育阶段的胚具有不同的渗透压要求。可用调节渗透压的方法来控制胚的发育，使其停留在某一阶段，然后同步发育。

4）分离过筛用不同孔径的尼龙网过滤或者采用密度离心法来选择不同发育阶段的胚，然后再转入适宜它们发育的培养基上，使幼胚继续发育。5）在悬浮培养中控制通气乙烯的产生与细胞分裂有着密切关系。在细胞分裂达到高峰前，有一个乙烯合成高峰。B、人工种皮的制备用于人工种皮的材料人工种皮需要满足下列要求：1）一定得透气性，不能影响胚状体的呼吸；2）一定的硬度；3）播种后易于降解；4）含有其他有利于胚状体存活、生长的成分，对特殊植物还需加入共生微生物以利共生发芽。体细胞胚包裹的材料

许多凝胶可以作为体细胞胚的包裹材料，如琼脂、琼脂糖、藻酸盐-明胶、淀粉、动物胶、角叉胶等。人工种子包裹方法1）干燥包埋法将胚状体置于23℃，相对湿度为79%，在黑暗条件下逐渐干燥，然后用聚氧乙烯包裹后贮藏。干燥包埋的体细胞有3%存活下来并发芽生长。2）凝胶包埋法将胚状体悬浮在一种黏滞的流体胶中，直接播入土壤。3