蛋白质组学与分析技术第一讲

蛋白质组学与分析技术任课教师：邱德文杨秀芬曾红/p>

qiudewen@中国农科院植物保护研究所课程名称：蛋白质组学与分析技术英文名称：ProteomicsanditsAnalysisTechnology

讲课课时：56学分：3蛋白质组学与分析技术课程教学大纲教学目的和要求教学对象：中国农科院硕士研究生知识背景：要求选修该课的学生基本掌握有关生物化学、分子生物学、普通生物学等相关农业学科的基本理论及实验方法。目的：通过农业蛋白质应用技术与实践学习掌握蛋白质组学的基本概念和学习了解蛋白质组学的现代分析技术。要求：通过课程的学习要求选修课程的学生熟知和掌握一个以上的蛋白质组学的分析技术及方法，促进蛋白质分析技术在今后研究生科研工作中的运用。课程重点与难点教学方法与教学设备要求：课堂讲解及提问讨论，多媒体教学与黑板书写相结合重点：讲授蛋白质组学的基本理论所涉及的研究内容（蛋白质分离纯化及制备）及分析技术（蛋白质相互作用、液质联仪及蛋白质结构与功能的分析技术）；难点：该课程内容多所设及的分析技术面广，有关仪器设备难以普及，实验费用比较高目前不能安排相关试验课程，所以有关内容比较抽象。课程内容：蛋白质组学主要讲授内容第一章蛋白质组学概念一、蛋白质组学概念二、蛋白质组学研究与分析技术特点三、蛋白质组学研究目的和意义四、蛋白质组学研究技术简介五、蛋白质组学与分析技术课参考书第二章蛋白质分离和提取的技术与方法一、蛋白质的分离技术二、蛋白质样品的制备原则三、从生物样品中抽提蛋白质时需要考虑的几个因素四、影响蛋白质纯化的因素五、蛋白纯化技术六、蛋白质的浓缩技术七、蛋白质组学与分析技术课参考书第三章蛋白质电泳分析技术一、蛋白电泳类型二、2-DE电泳的蛋白样品制备技术三、2-DE电泳技术三、2-DE分离后的蛋白检测四、蛋白质电泳图像分析五、双向凝胶电泳面临的问题第四章蛋白质层析分析技术与方法一、吸附层析（AdsorptionChromatography）二、离子交换层析(IonExchangeChromatography，IEC)三、凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatograpHy)四、亲和层析(affinitychromatograpHy)五、聚焦层析(focusingchromatography)六、蛋白质的分析制备七、高效液相层析与质谱分析第五章高效液相色谱和质谱联用仪在蛋白质组学中的应用一、高效液相色谱发展历史二、高效液相色谱的仪器组成、应用及特点三、样品的预处理技术四、高效液相色谱法的固定相和流动相的选择五、液相色谱法的蛋白质分离六、高效液相色谱的定性分析七、高效液相色谱在蛋白质研究中的应用八、质谱（MassSpectrometry，MS）第六章PCR技术在蛋白质组学中的应用

一、PCR的发展概况二、PCR技术的基本原理三、PCR的反应动力学四、PCR扩增产物五、PCR循环的主要参数六、PCR相关技术第七章基因文库与cDNA文库在蛋白质中的应用

一、基因文库二、基因文库的分析方法与技术三、cDNA文库四、cDNA文库的分析方法与技术第八章基因芯片技术在蛋白质组学中的应用

一、基因芯片技术及应用二、基因芯片操作流程图三、基因芯片操作实例第九章酵母双杂交技术在蛋白质组学中的应用

一、酵母双杂交的基本原理二、酵母双杂交系统的应用三、酵母双杂交体系的实验程序四、酵母双杂交系统的优缺点五、酵母双杂交技术应用的趋势及展望第十章基因敲除和RNA干扰技术在蛋白质组学中应用

一、基因敲除的原理二、基因敲除技术的分析与应用三、RNA干扰原理四、RNA干扰技术的分析与应用第十一章蛋白质表达系统的建立及应用

一、各种蛋白质表达系统及其特点二、在大肠杆菌中表达蛋白三、问题探讨四、蛋白质在植物中的表达第十二章蛋白质结构与功能解析一、蛋白质结构与功能分析二、蛋白质结构研究的历史回顾三、蛋白质结构与功能研究的国内外现状四、蛋白质单晶的培养五、生物大分子结构的测定六、蛋白质结构研究的最新方法参考书1、《蛋白质组学导论》[美]D.C.利布莱尔.科学出版社2、《蛋白质化学与蛋白质组学》.夏其昌，曾嵘.科学出版社3、《蛋白质结构分析：制备、鉴定与微量测定.》[德]RM坎普.科学出版社4、蛋白质与蛋白质组学实验指南》（影印版）.[澳]R.J.辛普森5、《蛋白质组学》[中]钱小红贺福初.科学出版社6、《蛋白质组学原理》[英]特怀曼.化学工业出版社7、《药物研究中的蛋白质组学》[美]哈马驰科学出版社8、《植物基因组学与蛋白质组学》[英]卡利斯化学工业出版社9、《基因组学、蛋白质组学与疫苗》[意]格兰迪10、《药物蛋白质组学》[中]郭葆玉人民卫生出版社11、《基因组研究手册基因组学、蛋白质组学、代谢组学、信息生物学、伦理学和法律问题》[加拿大]森森科学出版社12、《蛋白质与蛋白质组学：生命科学新视野2》[英]索伦森科学出版社13、《BayesianInferenceforGeneExpressionandProteomics基因表达与蛋白质组学贝氏分析》MarinaVannucci14、《蛋白质生物农药》[中]邱德文等.科学出版社考试方式课程论文：20%，根据所学蛋白质组学的概念和蛋白质组学在农业生产上的应用与蛋白质组学的现代分析技术和研究方法结合个人的科学研究或设想提出一个蛋白质组学分析技术的科学研究技术路线和主要研究内容。平时成绩：20%（课堂回答及出勤）期末考试（笔试）：60%第一章蛋白质组学的概念蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）：MarcWilkins20世纪90年代早期提出的，有“基因组学”（genomics）和蛋白质（protein）组合而成。蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。90年代初期开始实施的人类基因组计划，在经过各国科学家近20年的努力下，已经取得了巨大的成就。完成了人类基因的测序及二十余种模式生物（从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫）基因组全序列的测定工作。基因的表达方式错综复杂，同样的一个基因在不同条件、不同时期可能会起到完全不同的作用。关于这些方面的问题，基因组学是无法回答的。所以，科学家们进一步提出了后基因组计划，蛋白质组（proteome）研究是其中一个很重要的内容。

蛋白质组学是后基因组时代功能基因组学研究的新兴学科和热点领域。目前，蛋白质组学已从早期用双向电泳和凝胶蛋白鉴定进行蛋白质表达谱研究扩展到蛋白质研究的几乎所有方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋白质结构和蛋白质胞内移位等，可以理解为大规模研究蛋白质相关问题的学科。蛋白质的特征蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。蛋白质占人体重量的16%-20%。蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。蛋白质一级结构蛋白质氨基酸序列为蛋白质的一级结构，蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，以及二硫键的位置。TLYMSPDYAATTLEGLFHThr-Leu-Tyr-Met-Ser-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ala-Thr-Thr-Leu-Glu-Gly-Leu-Phe-His苏氨酸－亮氨酸－酪氨酸－甲硫氨酸－丝氨酸－脯氨酸－天冬氨酸－酪氨酸－丙氨酸－丙氨酸－苏氨酸－苏氨酸－亮氨酸－谷氨酸－甘氨酸－亮氨酸－苯丙氨酸－组氨酸蛋白质的二级结构二级结构：蛋白质分子局区域内，多肽链沿一定方向盘绕和折叠的方式，主要为Beta折叠和Alpha螺旋结构蛋白质的三级结构三级结构：蛋白质的二级结构基础上借助各种次级键卷曲折叠成特定的球状分子结构的空间构象。蛋白质的四级结构四级结构：多亚基蛋白质分子中各个具有三级结构的多肽链，以适当的方式聚合所形成的蛋白质的三维结构。蛋白质组对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组学（Proteomics）指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学；其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。功能蛋白质组学（functionalproteomics）功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体；将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。蛋白质组学强调的是针对蛋白质的一个整体思路，蛋白质组学自其出现起，就有两种研究策略。一种可称为“穷尽法”或“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组学研究技术，力图查清生物体内一切蛋白质，这种大规模系统性的策略较为符合蛋白质组学的本质。另一种策略是“差异法”（也称为“功能法”）它着重于寻找和筛选任何有意义的因素引起的不同样本之间的差异蛋白质谱，试图揭示细胞对此因素的反应途径、进程与本质，同时获得对某些关键蛋白的认识和功能分析。这种方法更趋向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法，技术上具有更高的可实现性，是目前蛋白质组学在应用上最具前景的领域。蛋白质组学的研究内容主要有两个方面结构蛋白质组学和功能蛋白质组学；结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析，蛋白质表达模式的研究室蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题；功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能和蛋白质间的相互作用。蛋白质的功能模式的研究是蛋白质组学研究的最终目标，目前主要集中在蛋白质组相互作用网络关系的研究，它是要揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深层次了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因的结构与蛋白质的结构和功能的关系。978Cell136,March6,2009蛋白质组学与分析技术特点

蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基（20/4）,而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。

蛋白质组学与分析技术特点内容多：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体比较、基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析、细胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、环境反应与调控、物种进化、新型药物靶分子、人体病理介导分子、病原菌毒性成分、植物信号识别、植物诱导抗性、免疫增产激发子、抗虫蛋白晶体、植物病害毒素、植物致病相关蛋白等等。分析技术面广：氨基酸组分、序列测定；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪；毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电泳；蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白质结构与功能；园二色谱；X光衍射；高能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学技术。蛋白质组学与分析技术特点分析技术面广：氨基酸组分、序列测定；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪；毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电泳；蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白质结构与功能；园二色谱；X光衍射；高能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学技术。蛋白质组学研究的最终目标

阐明生命细胞进行代谢、信号传导和调控网络的组织结构和动力学，并理解这些网络如何在病理中失去功能，又如何通过干预如药物和基因改变它们的功能。几乎所有的生理和病理过程，以及药物和环境因子的作用都依赖于蛋白质，并引起蛋白质的变化。反之，对蛋白质组变化的分析也能提供对上述过程或结果的重要信息。蛋白质组的研究不仅为生命活动规