第六章 植物原生质体融合技术-黄秀梅

第六章植物原生质体融合技术PlantProtoplastFusion◆What基本原理◆Why技术应用◆How技术方法微丝叶绿体线粒体质膜液泡细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图细胞壁由三种主要成分构成纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%◆What基本原理◆去除植物细胞壁以获得大量的原生质体◆诱导原生质体融合形成杂种细胞◆筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化◆从细胞团，愈伤组织到最后成株植物原生质体融合基本过程◆Why技术应用植物原生质体融合的意义：◆克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍◆为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件◆How植物原生质体融合技术方法植物原生质体的制备植物原生质体的培养植物原生质体的融合1、原生质体的概念及培养的意义2、原生质体材料来源3、原生质体的分离4、原生质体的纯化概念：除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体★植物叶片－取材容易－比较容易用酶解法分离★植物根尖组织－可由各种植物的种子萌发后取得★植物花粉－产生单倍体原生质体★愈伤组织、悬浮培养的细胞－细胞壁容易解离例:烟草叶肉细胞原生质体的分离1).材料的准备与消毒：2).酶解：3).纯化：4).原生质体的活力测定1).材料的准备与消毒选取在温室中生长两个月左右的烟草植株从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片经自来水冲洗干净后放入70%乙醇中进行表面消毒然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂2).酶解

用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮，将叶片切成2cm长的小片，然后放入含酶溶液中处理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，温度25～28℃下经3-4小时的酶解反应，其间轻轻摇动培养皿若干次）3).纯化

将酶解悬浮液通过300-400目网，以除去大的未消化的碎片 然后将含有原生质体的酶液收集在离心管中，低速离心，使原生质体沉于管底，倾去上清液 在离心管中加入适量洗涤液，再离心；重复此步骤3次，使酶解液充分除去； 最后用原生质体培养液离心一次分离、洗涤、纯化原生质体的试剂试剂分离洗涤纯化KH2PO427.2mgKNO3101mgCaCl2.2H2O1480mgMgSO4.7H2O240mgKI0.16mgCuSO4.5H2O0.025mg甘露醇13%纤维素酶4%果胶酶0.4%蔗糖----21%pH5.65.65.6与分离试剂相同与分离试剂相同4).原生质体的活力测定

形态： 把形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体释放到降低渗透压浓度的洗涤液或培养基中，即可见到分离后缩小的原生质体会恢复原态，成为正常膨大的一般是有活力的原生质体。

染色法： 用0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色 用荧光素双醋酸酯（FDA）染色，在荧光显微镜下观察到带有荧光的是有活力的原生质体FDA法的原理FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。荧光素在死细胞中不能积累。在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。FDA荧光素活细胞死细胞请思考活细胞死细胞FDA先用丙酮配成0.5%的母液，终浓度为0.01%原生质体分离纯化流程图浅层液体培养法：

在培养皿或三角瓶中注入3~4ml原生质体培养液，然后将纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养固体培养法 原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培养基中 此法优点有利于对单个原生质体的胞壁再生和对细胞团形成的全过程进行定点观察双层培养法

在固体培养基上，加入适宜原生质体胞壁再生和细胞分裂的液体培养基

细胞壁再生： 体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。 细胞分裂形成细胞团： 一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。 器官形成植株再生： 从愈伤组织诱导发生 胚状体发育原生质体的活力 影响因素：制备原生质体的方法，渗透压稳定剂种类、浓度，质膜稳定剂种类、浓度，温度和保温时间原生质体密度 起始密度一般为104-105个/mL细胞壁再生速度 植物种类和取材的生理状态；培养细胞所处的时期；酶解时所用质膜稳定剂种类原生质体培养的营养和环境 培养基 原生质体培养的环境：光照、温度、湿度细胞融合(cellfusion)概念： 又称细胞杂交(cellhybridizaion)：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。细胞融合的意义： 克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍 为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件植物原生质体融合基本过程◆盐类融合法◆高Ca2+和高pH值融合◆聚乙二醇（PEG）融合法◆PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法◆电融合法A.盐类融合法盐类融合剂种类硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物类：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠盐类融合的优缺点优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合B.高Ca2+和高pH值融合Ca2+浓度0.05mol/LpH9.5-10.5具体做法(以烟草为例)取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合;加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37℃下保温0.5h;用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值；两种原生质体的融合率达到10%。C.聚乙二醇（PEG）融合法Polyethyleneglycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH,平均相对分子量200-20000之间融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合用相对分子质量为1540的PEG处理40-50min；再用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到