第二十一章 现代分析方法进展

现代分析方法进展以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳包含电泳、色谱及其交叉内容，使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。capillaryelectrophoresis毛细管电泳1、双电层双电层是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的与表面异号的离子层，凡是浸没在液体中的界面都会产生双电层。在毛细管电泳中，无论是带电粒子的表面还是毛细管管壁的表面都有双电层。一、基础理论毛细管电泳1、双电层

一、基础理论毛细管电泳2、淌度、绝对淌度和有效淌度带电粒子在直流电场作用下于一定介质（溶剂）中所发生的定向运动称为电泳。单位电场下的电泳速度称为淌度。在无限稀释溶液中（稀溶液数据外推）测得的淌度称为绝对淌度。一、基础理论毛细管电泳2、淌度、绝对淌度和有效淌度电场中带电离子运动除了受到电场力的作用外，还会受到溶剂阻力的作用。实际溶液的活度、酸碱度的不同，使样品分子的离解度不同，电荷也将发生变化，这时的淌度称为有效淌度。一、基础理论毛细管电泳2、淌度、绝对淌度和有效淌度一般来说，离子所带电荷越多、离解度越大、体积越小，电泳速度就越快。一、基础理论毛细管电泳3、电渗、电渗流和表观淌度电渗是推动样品迁移的另一种重要动力。电渗是指毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发生的定向流动。一、基础理论毛细管电泳3、电渗、电渗流和表观淌度电渗是由定域电荷引起。定域电荷是指牢固结合在管壁上、在电场作用下不能迁移的离子或带电基团。一、基础理论毛细管电泳3、电渗、电渗流和表观淌度在定域电荷对溶液中的反离子吸引下形成了双电层，致使溶剂在电场作用下整体定向移动而形成电渗流（毛细管中的电渗流为平头塞状）。一、基础理论毛细管电泳3、电渗、电渗流和表观淌度一、基础理论毛细管电泳3、电渗、电渗流和表观淌度电渗流大小受到Zeta电势、双电层厚度和介质粘度的影响。一般来说，Zeta电势越大，双电层越薄，粘度越小，电渗流值越大。一、基础理论毛细管电泳3、电渗、电渗流和表观淌度在多数的水溶液中，石英（或玻璃）毛细管表面因硅羟基解离会产生负的定域电荷，产生指向负极的电渗流。一、基础理论毛细管电泳3、电渗、电渗流和表观淌度在毛细管电泳中，样品分子的迁移是有效电泳淌度和电渗流淌度的综合表现，这时的淌度称为表观淌度。一、基础理论毛细管电泳3、电渗、电渗流和表观淌度电渗在电泳分离中扮演着重要角色。电渗流速度一般是电泳速度的5-7倍。因此，在毛细管电泳中利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移，同时完成正、负离子和中性分子的分离测定。一、基础理论毛细管电泳3、电渗、电渗流和表观淌度一、基础理论毛细管电泳1、毛细管区带电泳

Capillaryzoneelectrophoresis（CZE）毛细管和电极槽内充有相同组分和相同浓度的电解质溶液（缓冲液）。它是最基本、应用最普遍的一种分离模式二、分类毛细管电泳2、毛细管等速电泳

Capillaryisotachophoresis（CITP）二、分类毛细管电泳3、毛细管等电聚焦

CapillaryIsoelectricFocusing（CIEF）毛细管内壁经涂层处理使电渗流减到最小，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别为酸和碱，加高电压后，在毛细管内产生pH梯度，样品的各成分在毛细管中迁移至各自的等电点，形成区带，再进行检测。二、分类毛细管电泳4、毛细管凝胶电泳

Capillary

gel

electrophoresis（CGE）在毛细管内填充了多聚物作为分离介质，填充凝胶对分子的泳动起着阻碍作用。其作用机制类似平板电泳凝胶的筛网作用，大分子较小分子所受的阻碍大，泳动速度减慢。二、分类毛细管电泳5、毛细管胶束电动色谱

Micellar

electrokineticcapillarychromatography将离子型表面活性剂（如SDS）加到缓冲液中，这类分子一端为亲水基团，其余部分为疏水内核，亲水基团在表面，中性粒子因其本身疏水性不同而得以分离。二、分类毛细管电泳6、毛细管电色谱

Capillaryelectrochromatography（CEC）将HPLC中的固定相微粒填充到毛细管中（或涂渍在管壁上）。以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。二、分类毛细管电泳毛细管电泳通常使用内径为25-100μm的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管。标准毛细管的外径为375μm，有些管的外径为160μm。三、特点毛细管电泳毛细管的特点：容积小（100cm×75μm的容积仅为4.4μL）侧面/截面积比大，因而散热快、可承受高电场（100-1000V/cm）；

可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；

在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。三、特点毛细管电泳毛细管电泳系统的基本结构包括进样系统、毛细管、两个缓冲液槽、高压电源、检测器、控制系统和数据处理系统。四、仪器毛细管电泳四、仪器毛细管电泳四、仪器毛细管电泳四、仪器毛细管电泳UV激光光热荧光激光诱导荧光安培电导质谱CE具有多种分离模式，应用十分广泛，通常能配成溶液或悬浮溶液的样品（除挥发性和不溶物外）均能用CE进行分离和分析，小到无机离子，大到生物大分子和超分子，甚至整个细胞都可进行分离检测。五、应用毛细管电泳（一）在碱性药物分析中的应用（二）在手性药物分析中的应用（三）在蛋白质类药物分析中的应用

SDS-GelMolecularWeightAnalysis

IsoelectricFocusingAnalysisCarbohydrateAnalysisPeptideMapping五、应用毛细管电泳（四）在药物制剂分析中的应用（五）在药物与蛋白质相互作用研究中的应用（六）在药物杂质检查中的应用（七）在中药分析中的应用（八）在生物样本中的药物及其代谢产物分析中的应用五、应用毛细管电泳1982年由美国国立卫生研究院（NationalInstitutesofHealth，NIH）的YoichiroIto博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术。High-speedCountercurrentChromatography高速逆流色谱与其它色谱技术不同的是它不需任何固态载体，因此能避免固相载体表面与样品发生反应而导致样品的污染、失活、变性和不可逆吸附等不良影响。High-speedCountercurrentChromatography高速逆流色谱液-液萃取一、基本原理高速逆流色谱高速逆流色谱是建立在单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流色谱分离方法，它是在研究旋转管的流体动力平衡时偶然发现的。一、基本原理高速逆流色谱当螺旋管在慢速转动时，螺旋管中的两相都从一端分布到另一端。用某一相作移动相从一端向另一端洗脱时，另一相在螺旋管里的保留值大约50%，但这一保留量会随着移动相流速的增大而减小，使分离效率降低。一、基本原理高速逆流色谱但使螺旋管的转速加快时，两相的分布发生变化。当转速达到临界范围时，两相就会沿螺旋管长度完全分开，其中一相全部占据首端的一段，我们称这一相为首端相，另一段全部占据尾端的一段，称为尾端相。一、基本原理高速逆流色谱高速逆流色谱正是利用了两相的这种单向性分布特征，在高的螺旋管转动速下，如果从尾端送入首端相，它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端相送入尾相，它将穿过首端相而移向螺旋管的尾端。一、基本原理高速逆流色谱分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相（固定相），然后从合适的一端泵入移动相，让它载着样品在螺旋管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多，分离效果越好，且大大地提高了分离速度，故称高速逆流色谱。一、基本原理高速逆流色谱1．逆流色谱不用固态支撑体，完全排除了支撑体对样品组分的吸附、玷染、变性、失活等不良影响。所以，能避免不可逆吸附所造成的溶质色谱峰拖尾现象，能实现很高的回收率。例如，对于黄酮等易被填料吸附的物质的分离与制备就具有明显的优势。二、特点高速逆流色谱2．逆流色谱的分配分离是在旋转运动中完成的，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场依其界面特征形成极微小的颗粒，样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并且能在颗粒振荡与对流的环境中有效地传递。所以，它就象是把通常的溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续地予以完成。二、特点高速逆流色谱3．没有填料在柱内的占空体积，逆流色谱的柱内空间全部是有效空间。所以，它的样品负载能力很强，制备量很大，而且重现性很好。二、特点高速逆流色谱三、仪器高速逆流色谱SeparationandpurificationofnaturalbioactivemoleculesSeparationandpurificationofsynthesizedcompoundsFingerprintandqualitycontrolresearchofTraditionalChineseMedicineSeparationandpurificationofantibioticsSeparationandpurificationofproteinsandpolypeptidesChiralseparation四、应用高速逆流色谱ThisnewcategoryofanalyticalseparationscienceretainsthepracticalityandprinciplesofHPLCwhileincreasingtheoverallinterrelatedattributesofspeed,sensitivityandresolution.UltraPerformanceLiquidChromatography超高效液相色谱vanDeemterequation：H=A+B/u+Cu

H=a(bp)+b/u+c(dp)2u颗粒度越小柱效越高；每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。一、原理超高效液相色谱降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高了分析速度。一、原理超高效液相色谱使用更高的流速会受到色谱柱填料耐压及仪器耐压的限制。反之，如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效就无法体现。另外，更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。一、原理超高效液相色谱Waters公司在传统HPLC系统基础上开发的超高效液相色谱系统突破了色谱科学的瓶颈，充分利用了传统HPLC望尘莫及的小粒度色谱柱的优势，使色谱分离的解析度达到新的高度。在仪器工艺方面，WatersACQUITYUPLC™采用了新型的色谱填料及装填技术，配备了优秀的超高压液相色谱泵、自动进样器、高速检测器，并优化了系统的综合设计，使仪器分析能力大大增强。一、原理超高效液相色谱色谱填料超高压液相色谱泵自动进样器高速检测器二、仪器超高效液相色谱Waters公司利用1999年发明的杂化颗粒技术，合成了1.7um颗粒度的第二代有机硅填料。它使用双（三乙氧基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团。这样合成出来的填料在其内部有了更多的"交联"结构，其机械强度有了极为显著的提高，耐压超过了20000psi。二、仪器超高效液相色谱Waters公司的ACQUITYUPLCTM使用了更严格的筛分技术使1.7um填料的分布很窄，并且使用了全新筛板及其他色谱柱硬件（柱管及其连接件），在超过20000psi的压力下装填。二、仪器超高效液相色谱ACQUITYUPLCTM装备一台独立柱塞驱动、四个溶剂切换的两元高压梯度泵，其1ml/min流速时的耐压可达15000psi，具有精确、可靠的梯度性能。新型的超高压输液泵使独特的小颗粒填料技术可以在最优化的流速下工作，以充分发挥其特点。二、仪器超高效液相色谱为了降低死体积、减少交叉污染