2023体外诊断医疗器械 核酸多重分子检测 第1部分：核酸质量评价术语和通用要求

1II目 次前 言 II引 言 III范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1总则 7通则 8分析前的考虑因素 8标本质量的考虑因素 8核酸质量的考虑因素 8多重分子检测核酸质量与评价 9多重分子检测的核酸质量评价 9核酸量的评价 9核酸的制备程序 105.1通则 105.2样品准备 105.2.1通则 10组织样本制备的考虑因素 10核酸的提取和纯化 11质量评价方法 11附 录 A（资料性）评价RNA完整性 13附 录 B（资料性）评价DNA的完整性 14附 录 C（资料性）利用PCR评价来源于FFPE样品的可扩增DNA 15附 录 D（资料性）MicroRNA样品 17参 考 文 献 18PAGEPAGE10体外诊断医疗器械-多重核酸分子检测第1部分：核酸质量评价术语和通用要求范围同时识别两个或更多核酸靶序列的检测手段。本文件适用于所有的多重分子检测方法，用于体外诊断（IVD）医疗器械和实验室自建检测（LDTs）的检验，并提供核酸靶序列定性和定量检测的信息。本文件目的为指导多重分子试验中检测和/或定性人体临床标本中人类核酸或者微生物病原体核酸注：实验室内部使用的检验方法称为“实验室自建方法”，“LDT”，或者称为“in-housetest”。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T22576.1-2018医学实验室——质量和能力的要求第一部分：通用要求。术语和定义下列术语和定义适用于本文件。ISO和IEC维护用于标准化的术语数据库，地址如下：——SOp/ww.s.or/bp——IEC电子百科：http://electropedia./org3.1准确度accuracy测量结果与真值之间的一致程度。注1：术语“准确度”，当用于一组测试或测量结果时，由随机误差分量和系统误差分量即偏倚分量组成（ISO3534-2：2006，3.3.1）。[SOIC指导原则9207,,13“注释1”“注释2”“注释”加了新的“注释1”]3.2算法algorithm可用于生成合理解释或可报告结果的检测数据的一组规则或计算方法。3.3等位基因allele<遗传学>控制遗传变异的一个基因的不同形式。一个可以被替代的多态性DNADNA占据一个确定的一个基因位点，可以被替代的基因形式之一。3.4等位基因比例allelicratio特定等位基因（3.3）占总等位基因数量（3.3）的百分比，通常用分数表示。（3.3）数量的40%，那么等位基因比例为注2：等位基因比例等同于等位基因频率。3.5分析物analyte以可测量含量名称表示的组分。[来源：ISO17511:2020,3.1,有修改]3.6化学纯度chemicalpurity表示影响多重分析的化学物质的污染程度。注1：PCR的核酸纯度是经过提取步骤去除了有干扰作用的有机物质和蛋白质组分，以及核酸的污染。3.7DNA微阵列DNAmicroarrayDNA芯片DNAchip以高密度方式直接或间接集合的DNA探针阵列，可用于高通量筛选大规模生物物质的固态基质。[来源：ISO16578:2013,3.3]3.8文件化程序documentedprocedure执行特定的活动或者是文件制定、操作和维护实验室间比对的过程（3.13）3.9评价方法evaluationmethod用于核酸质量评价的方法3.10有效期expirydate截止日期expirationdate在指定条件下，确保储存物质特征性能的时间范围上限注1：IVD试剂（3.16）、校准品、质控品和其他组分的有效期由制造商根据实验确定的稳定性（3.38）特性指定。[来源：ISO18113-1:2009,3.17,有修改]3.11外部测量标准品externalmeasurementstandard参考标准品referencestandard为测试多重分析方法的互换性而准备的材料或物质，其特征值是在某个科学或工程组织资助下的协作实验工作中得到的一致值。注1：通常针对多重分子分析。注2：标准物质也可以作为外部测量的标准。[来源：ISO16578:2013,3.9,修订——增加“注释1”和“注释2”]3.12预期用途intendeduse预期目的intendedpurpose体外诊断制造商在规格、使用说明和体外诊断制造商提供的信息中给出的关于产品、过程或服务使用的目标意图。[来源：ISO18113-1:2009,3.31,修订——删除了“注释1”和“注释2”]5

实验室间比对interlaboratorycomparison按照预先规定的条件，由两个或多个实验室对相同或类似的项目进行测量或检测的组织、实施和评[SOIC703:01,.]体外诊断设备invitrodiagnosticinstrumentIVD设备IVDinstrument制造商用于体外诊断医疗器械的设备或仪器（3.15）[来源：ISO18113-1:2009,3.26,修订——删除了“注释1”]体外诊断产品invitrodiagnosticproduct体外诊断医疗器械invitrodiagnosticmedicaldeviceIVD医疗器械IVDmedicaldevice（剂、仪器和系统。[来源：美国联邦食品药品和化妆品法案21CFR809.3]3.16体外诊断试剂invitrodiagnosticreagentIVD试剂IVDreagent被制造商预期用作体外诊断医疗器械的化学、生物学或免疫学组分、溶液或制备物（3.15）[来源：ISO18113-1:2009,3.28修订——删除“注释1”]3.17实验室自建检测laboratorydevelopedtestsLDTs一个独立实验室内部设计、制造和使用，以临床应用为目的的体外诊断器械的形式。注1：也被称为“in-housetest”。[来源：CLSIQSRLDT]3.18检出限limitofdetectionLOD由给定的测量程序得到的测得量值，对于此值，在给定声称物质中存在某成分的误判概率为α时，声称不存在该成分的误判概率为β。注1：IUPAC建议α和β的默认值等于0.05.注2：这适用于当测试评价是否存在多种分析物(3.5)而不是多变量分子检测(3.26)时的LOD。注3：检出限(LOD)可以被定义为：1）在给定的置信度内，可以被可靠测序到，并能区别于不存在的最低核酸量；2)给定样品中可检测到的最小等位基因组分。3.19微阵列平台的检出限limitofdetectionformicroarrayplatform多重分子检测的检出限limitofdetectionformultiplexmoleculartestplatformLODP在5%置信区间范围内，可以通过实验持续检测到的外部测量标准品（311（或标准物质）的（11（测定/估计注1：通常针对多重分子检测；注2：LODP可作为一个替代多重分析检出限（3.18）的性能指标。[来源：ISO16578:2013,3.1,修订——增加“注释1”和“注释2”]3.20大规模平行测序massiveparallelsequencing通过并行处理大量分子实现高通量DNA测序的方法。注1：例如，包括但不限于可对数千至数百万短读长（≈50至400个碱基）进行测序的微型化和并行化的测序平台，或基于聚合酶的可实现长读长（平均长度≈10,000-15,000个碱基）的实时DNA测序平台。3.21microRNA与转录后表达调控有关的17至25个核苷酸长度的单链RNA3.22多重序列分析物multiplesequencesofanalyte(s)同时测量一个样品中的多个核酸序列的成分。注1：这包括提取的核酸和基于核酸扩增试验的扩增前和/或扩增后的核酸。3.23多重分子检测multiplexmoleculartest可以在单次分析中同时评价序列特征和/或多个（≥2个）核酸靶标数量的体外诊断检测，例如基于多重PCR(3.24)、多重杂交检测、微阵列和基于大规模平行测序(3.19)的方法。注1：“多重”被定义为“通过统一的样品制备、目标或信号扩增、等位基因（3.3）区分和信息采集同时实现两个或更多目标的检测。注2：靶标是指除了内参以外的检测目标。3.24多重分子核酸检测级别的核酸multiplexmoleculartestqualitynucleicacid(363403.25多重PCR multiplexPCR在一个反应体系中应用多对引物同时产生多个扩增子的PCR技术。[来源：ISO16577：2016，3.117]3.26多变量分子检测multivariablemoleculartest使用解释函数将多个变量的值组合在一起的分子检测，它能够产生一个独立的、患者特异的结果，包括“分类”，“评分”和/或“指数”。注1：这类检测通常基于多重分子检测平台。注2：旨在用于疾病或其他状况的诊断，或用于治愈、缓解、治疗或预防疾病。注3：统计词语“多变量”表示对多个结果进行评价，而不是使用多个变量评价一个结果。3.27病原体pathogen引起宿主疾病的致病性微生物。注1：病原体包括某些病毒、类病毒、朊病毒、细菌、真菌或寄生虫。[来源：ISO15714:2019,3.1.2,修订]3.28PCR级别的DNAPCRqualityDNA具有足够长度、数量、化学纯度(3.6)和结构完整性(3.40)的，用于PCR反应的DNA模板。[来源：ISO24276::2006,3.2.3,修订——增加了“数量”]3.29分析前阶段preanalyticalphase检验前过程pre-examinationprocesses按时间顺序自临床医生申请至分析检验启动的过程，包括检查申请、患者准备和识别、原始样品采集、以及在实验室内外的运送、分析物分离。[来源：ISO15189:2012，3.15，修订——增加了“分析物分离”]3.30原始样品primarysample标本specimen一种体液或组织的分离部分，用于检查，研究或分析一种或多种假定适用于整个人体的数量或特性。注1：全球协调工作组(GHTF)在其协调指导文件中用“specimen”表示医学实验室检验用生物源样品。注2：在某些国际标准化组织(ISO)和欧洲标准化委员会(CEN)文件中,“标本”定义为“来自人体的生物样品”。注3：在某些国家,用“标本”代替原始样品(或其分样品),指准备送至实验室或实验室收到的供检验用的样品。[来源：ISO15189:2012,3.16]3.31可靠的信号范围rangeofreliablesignal提供的与外部测量标准品（.10（或标准物质）的浓度和/或拷贝数成比例的结果的能力（在给定范围内）注1：主要用于定量检测，但不用于定性测试。注2：也可用于线性范围或分析可测量范围。[来源：ISO16578:2013,3.2,修订——增加了“注释1”和“注释2”]3.32可报告范围reportablerange实验室检测覆盖的基因组中可接受质量序列的区域。示例1：可报告范围也被定义为“仪器、试剂盒或系统的测量结果的有效测试值范围”（USCFR493）。3.33参考区间referencerange检测试剂盒可检测到并可报告的正常人群中的序列变异注1：参考区间也被定义为基于健康状况人体的一组涵盖实验室检测上限和下限的值。3.34RT逆转录reversetranscription逆转录酶与RT引物、脱氧核糖核苷三磷酸结合，从RNA模板合成DNA的过程。[来源：ISO22174:2005,3.3.1]3.35逆转录聚合酶链反应RT-PCR由两个反应组成的方法：从RNA到DNA的逆转录（3.32）并进行PCR的过程。[来源：ISO22174:2005,3.4.2]3.36RT-PCRRNART-PCRqualityRNA具有足够长度，数量，化学纯度和结构完整性的RNA模板，适用于逆转录（3.32）和PCR反应。[来源：ISO22174:2005,3.4.2，修订]3.37样品sample从原始样品中取出一个或多个部分[来源：ISO15189:2012,3.24，修订——该示例已被删除]3.38稳定性stability体外诊断医疗器械（3.15）在制造商规定限度内保持其性能特性的能力注1：稳定性适用于：当体外诊断试剂（16、校准物或质控物在制造商规定的条件下储存、运送和使用时——按照制造商使用说明制备、使用和贮存的复溶后冻干材料，工作溶液和从密封容器中取出的材料。注2：体外诊断试剂（3.16）或测量系统的稳定性通常用时间量化：——计量性质按规定量变化的时间间隔；——一定的时间间隔内特征的变化。[来源：ISO18113-1:2009,3.68，修订——在校准后的测量仪器或测量系统，注释1和注释3已被删除]3.39标本稳定性specimenstability长期储存过程中，样品的抗质变能力。[来源：ISO23833:2013,5.5.10，修订]3.40结构完整性structuralintegrity反映核酸原始状态的保留程度。3.41确认validation通过提供客观证据对特定预期用途（3.12）或应用要求已得到满足的认定注1：“已确认”一词用于表明相应的状态[来源：ISO9000:2015,3.8.13，修订——注释1和注释3已被删除]3.42验证verification通过提供客观证据，对规定要求已得到满足的认定示例1：单词“已验证”用于指定相应的状态。示例2：确认可以包括以下活动：——执行替代计算——将新的设计规范与类似的经过验证的设计规范进行比较——进行测试和演示，以及——签发前审查文件[来源：ISO9000:2015，3.8.12，修订——注释1和注释2已被改写]总则通则分析前的考虑因素ISO15189：2012中5.4.7和ISO/TS20658[3]ISO15189：2012，5.3。另外，ISO15189：2012、和也可能适用。分析前阶段通常由以下工作流程组成：——样品的采集、贮存和运送；——样品的预处理；——核酸的提取和纯化。（DNA、RNA），由此造成的分析前变异可严重影响分析检测结果。例如，福尔马林固定前的热缺血和冷缺血多重分子检测是可同时测量两个或多个目标核酸序列的IVD检测试剂或医疗器械。多重分子检测宜使用高质量的样品进行，以确保符合检测目的。标本质量的考虑因素（如果需要以确保核酸质量适合要检测的所有分析物或靶标。多重核酸分子检测用的靶标盘包括高水平和低水平的靶标。核酸质量的考虑因素注：CLSIMM17-A指南提供了多重检测的验证和确认的各个方面的建议[24]多重分子检测核酸质量与评价多重分子检测的核酸质量评价"PCR级别的DNA"在ISO22174、ISO16577和ISO20395中有描述。在ISO16577中，它被描述为具有足够长度、质量和结构完整性的DNA模板，可以通过PCR扩增。"RT-PCR级别的RNA"也在ISO22174中有描述，为适用于逆转录和PCR的具有足够长度和数量的RNA模板。但是，这些不适用于基于PCR、RT-PCR、微阵列和大规模平行测序中多重分子检测的测量方法。考虑到多重分子检测是一种能够同时检测多个核酸序列甚至是长度较短的核酸的分子生物学技术，应开发适用于每个测量系统的多重分子检测的优质核酸的评价方法应被开发。或RNA）。用户应根据后续使用的多重分子检测选择最合适的方法。/或荧光法和/或凝（（即加入已知精确定量的目标分析物的样品）示例1：RNA的质量可以通过电泳图评价，方法是含有总RNA的样品的28S:18S核糖体RNA的比率，RNA完整性数值（RIN值），或RNA完整性得分（RIS）[31][32]尽管基于核糖体RNA的质量指标常用于RNA质量分析，但并不常用于评价信使RNA的质量[33]。示例2：A260/A280和A260/A230的比值可以用来评价RNA的纯度。PCR对于某些多重分子检测，确保核酸样品质量的关键方面是确定目标核酸是否存在目标核酸。例如，对特定来源组织或生物体的低丰度核酸靶标的多重分析宜确保样品包含来自该组织/生物体的核酸。该注：为了提高对存活病原体的检测，可以同时测量核糖体RNA或信使RNA。另一种方法，可以考虑用DNA嵌入剂处理细菌，该嵌入剂可穿透灭活细胞并抑制PCR扩增，而不能穿透活细胞。示例：对于多重连接依赖探针扩增（MLPA），两个变性片段（D-片段）被用来用于指示由于DNA样品中的盐类污染物导致的不良DNA变性。核酸量的评价根据多重分子检测的目的应该选择合适的方法来评价核酸量。（核酸的制备程序通则所采用的核酸提取方法应适合于获得后续分析所需的核酸的质量和数量。样品准备1：足够数量人体细胞的黏液标本。标本量不足会导致假阴性结果。为了验证潜在非最优样品导致的阴性结果，可同时检测人基因组序列作为内部对照。2：目标分子的相对减少，从而导致靶序列的低估或假阴性结果。3：L-半胱氨酸和半碱性蛋白中使此现象降至最小化。cut-off值的定量检测方法，对影响进行评价。1在血液感染细菌病原体多重检测中，血液采集过程中可能发生正常人体皮肤菌群（如凝固酶阴性葡萄球菌2性，如戈登分支杆菌、龟分支杆菌或猿分支杆菌。这种情况可以通过使用无菌收集设备如支气管镜减少。组织样本制备的考虑因素对于FFPE标本，福尔马林固定处理会造成核酸的片段化和化学修饰。因此，福尔马林固定处理最好使用合适的固定剂，如标准福尔马林缓冲溶液，在低温下尽可能短时间内完成[2][6][30]。注1：各种样品类型（例如FFPE，冷冻组织和血液）的检测前工作流程在ISO20166，ISO20184和ISO20186系列中有描述[6][7][8]；注2：中性缓冲福尔马林（NBF）通常用于固定过程；注3：从较旧的福尔马林固定石蜡包埋块（例如大于3年）中获得的DNA通常显示胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶，这可能导致DNA序列C：G到T：A的转变。用尿嘧啶-N-糖基化酶处理能消除这类样品中含有尿嘧啶的DNA分子。另外，可通过评价大规模平行测序分析中测序数据的转换和颠换的比例来检测是否存在显著的脱氨基现象。注：大规模平行测序分析的目标区域内包含多态性基因组区域（如用于法医分析的区域）可用于评价正在测序的样品中是否存在一个以上的患者基因组。核酸的提取和纯化在选择核酸提取或纯化方法时，应考虑标本类型和基质对将提取或纯化的核酸在每个多重检测中的影响。在使用某些高灵敏度的多重方法进行检测时，来自试剂、纯化柱和塑料器皿的核酸潜在污染可能导致/样品的操作规程，并进行记录和遵循，从而最大程度地减少交叉污染的影响。注：部分试管材料会结合核酸。聚乙烯醇-聚丙烯材料制成的试管相较于标准的聚丙烯微量离心管，对DNA的吸附100ngDNA0.02%的聚乙烯醇山梨醇单月桂酸酯，可减少管壁对DNA的吸附[30]。注：当使用珠磨法破碎真菌细胞壁或组织进行提取时，过于激烈的提取可能导致核酸的断裂。质量评价方法60260）与280nm（A280）[31]A260/A280比值不能评价测序用的片段质量。注：DNADNADNAA260/A280（例如2.00）不适合作为样品纯度指标来进行测序DNA的浓度和片段质量料来特异性测量双链DNA。A260/A280A260/A2801.60，表明该样品中可能存在潜在的干扰化合物，如蛋白质、酚、胍或其他试剂。在清除过量的引物/单链DNA等杂质后，A260/A280比值也可用于确定PCR产物的纯度。注：A260值也用于测量总核酸的产量。当A260值异常高时，提示可能会存在基因组的污染。例如，在从血浆中测量HIV病毒时，高的A260值可能是来自白细胞的基因组DNA污染的指标。直接评价DNA片段的断裂状态的方法包括电泳直接确认、评价已知长度DNA片段的PCR扩增（例如内部对照基因β-球蛋白或维生素DPCR中的定量循环，也称为循环阈值，Ct或交叉点，Cp）值评价扩增反应。测序的片段长度可以通过毛细管电泳尺寸分离进行预测或通过克隆及Sanger测序来预测。评价RNA断裂的方法包括使用变性琼脂糖凝胶电泳直接测量RNA的构象。此外，可以通过核糖体NRNANA3-（APH）或β-actinRNA质量评价，可以使用RIN值或RIS和/或由电泳得出的核糖体RNA的18S单位和28S单的比率。注1：RIN和基于核糖体RNA的质量指标分析并不总是对信使RNA的自然降解提供有用的指标，尤其是对于FFPE样品。对于来自FFPE的RNA，建议使用基于公式的石蜡包埋RNA（PERM）算法，该算法近似计算了从提取的RNA的电泳图下的加权曲线区域分析。相比之下，PERM算法比RIN更好[34]。注2：RNA测序的目标是以量化精确度来确定样品中的RNA含量。RNA测序是通过分离靶标的RNA分子（或选择性去除不重要的分子），将其转化为双链cDNA，并在测序反应中使用而实现的。在核酸提取、扩增和检测阶段使用内部质控可以是核酸质量评价的有用工具，估计抑制剂的影响，注：在PCR中，可以使用多重内部扩增质控，其中包含多个感兴趣靶标的正向和反向引物结合区域。附录 A（资料性）RNA通过毛细管电泳评价RNA完整性的方法包括RNA完整值RIN值和RNA完整性评分RIS值[2][31][32]RIN值是通过电泳获得RNA片段分布大小图谱来详细评价RNA的完整性[2][35]。由此开发的一种软件算法，可以比核糖体比率方法更好地评价RNArRNARNA附录 B（资料性）评价DNA的完整性DNA完整值（DIN）算法的开发，目的在于提供一个评价DNA完整性的客观标准的工具。DIN通过信号分布范围来确定基因组DNA附录 C（资料性）利用PCR评价来源于FFPE样品的可扩增DNA从福尔马林固定的组织中提取的DNA是片段化的，并且包含DNA突变，这是序列错误的来源。特别是，大量的片段化使PCR扩增的模板量显著减少。第二个主要问题是FFPEDNA中出现错误的序列，而在原始样品中这些突变是不存在的。福尔马林固定的组织DNA常见的损伤形式是DNApH值降低，组织中DNA的断裂程度逐渐加剧。因此，即使来自不同样品的相同量的FFPEDNA，可用于扩增的模板量可能显著不同，这取决于DNA的碎片损伤的程度。甲醛诱导的DNA交联会降低双链DNADNADNA的断裂程度逐渐加剧[37]pHpH在FFPEDNA检测到的序列突变中，C:G>T:A转换是最常见的SNV变化类型。基于扩增的方法检测拷贝数较低的F