奶牛布氏杆菌病的诊断与防治

奶牛布氏杆菌病的诊断与防治

草坪病，也被称为狼病，是由肠球菌引起的自然流行病。该病可感染人类、多种家畜和野生动物,引起相似的临床症状与病理损伤,如发热、流产、死胎、不育等,造成巨大的经济损失,导致严重的公共卫生问题,危害人类健康。家畜布氏杆菌病常发生于牛、猪、羊,是引起人类布氏杆菌病的主要传染源。为此,世界动物卫生组织(OIE)将布氏杆菌病列为B类动物疫病,我国将其列为二类动物疫病,是国际贸易卫生检疫中必检的传染病。2008年10～12月份期间,某规模养殖场先后从天津、唐山、西安引进奶牛258头,与本地奶牛混群饲养。随着奶牛的大量异地调运,该场布病疫情出现快速上升的趋势。2009年6月份至11月份,该场布病感染阳性奶牛的比例从0.85%上升到5.89%;从2009年11月10日～2010年2月11日,在3个月的时间内感染牛群中44头奶牛发生了流产、死胎。上述结果证实,该规模养殖场发生了布氏杆菌野生强毒株的侵袭和蔓延。严峻的布病疫情不仅制约了奶牛业的可持续发展,而且威胁着牛乳及其乳制品的安全,成为影响国计民生的一件大事。我国对家畜布氏杆菌病采取以检疫净化为主的综合防控措施,同时包括对重点疫区的易感动物接种疫苗,待临床病例逐渐减少和疫情得到有效控制以后,再实施群体和地域的净化。为此,该规模养殖场对布病阳性牛进行隔离淘汰处理,对布病阴性牛(假定健康牛)进行免疫接种。现将奶牛群接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗的免疫效果报告如下。1材料和方法1.1内使用—试剂、疫苗布病虎红平板凝集试验抗原和试管凝集试验抗原购自青岛易邦生物工程有限公司,在有效期内使用,按GB/T18646—2002规定的程序操作;S2株布氏杆菌活疫苗购自中牧实业股份有限公司兰州生物药厂,每瓶含布氏杆菌弱毒活菌4000亿CFU,用生理盐水稀释疫苗,每头奶牛口服接种500亿活菌剂量,以投药器喷注到牛舌根及咽喉部免疫。1.2疫苗安全试验口服接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗以后,观察奶牛群的疫苗接种反应,记录疫苗接种前后一个月的泌乳牛产量。1.3服免疫对布病感染牛群控制排流率根据奶牛场的生产记录,逐月统计疫苗接种前后能繁母牛发生流产、死胎的病例数,了解口服免疫对布病感染牛群控制流产率的效果;口服接种活疫苗以后15d、30d、45d、60d和90d,对免疫奶牛群按20%的比例随机抽取血液样本,定性(虎红平板凝集试验)和定量(试管凝集试验)检测血清中的布氏杆菌抗体水平,了解活疫苗诱导的抗体消长动态。1.4pcr检测omp25基因的扩增10×PCRBuffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、D200DNAMarker等购自大连宝生物工程有限公司。按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T1467—2007),从鲜乳样本提取总DNA作为模板,针对布氏杆菌OMP25基因合成内外两对引物,采用嵌合式PCR方法进行扩增,扩增完成以后取5μLPCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。同时以S2株布氏杆菌活疫苗作为阳性对照,灭菌双蒸水作为空白对照,预期扩增片段长度为419bp的DNA条带。2结果2.1泌乳牛和牛奶产量奶牛群接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗以后,均未观察到任何接种反应,包括发热、呼吸急促、食欲下降、流产和死胎等症状;接种疫苗前一个月泌乳牛产量达到13.65kg,接种疫苗后一个月泌乳牛产量为13.66kg,对牛奶产量没有显著的影响。结果表明S2株布氏杆菌减毒活疫苗口服接种是安全的。2.2接种疫苗之前是否能繁民法?2010年2月14日该奶牛场口服接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗,疫苗接种前后逐月统计能繁母牛的流产率,结果见图1。接种疫苗以前3个月,布病感染奶牛场中能繁母牛的月平均流产率达到4.55%,2月上旬出现流产高峰(7.34%);接种疫苗以后,能繁母牛的月平均流产率降低至2.11%,目前控制在1%以下。试验结果证实,S2株布氏杆菌减毒活疫苗能有效控制布病感染牛群流产、死胎率,减少能繁母牛因流产、死胎导致的经济损失。2.3免疫牛检测抗体水平奶牛群接种疫苗以后,定期采集血清样本检测疫苗诱导的抗体水平,结果见表1。奶牛接种疫苗以后15d,即可检出疫苗诱导的布氏杆菌抗体,29.7%的免疫牛显现虎红平板凝集阳性(血清学转换);30d抗体水平达到高峰(36%);45～90d抗体阳性率呈现缓慢下降的趋势(31.1%→245%)。试管凝集定量检测的抗体效价较低,5.6%～14%的血清样本抗体效价为1:50;6.9%～10.8%的血清样本抗体效价达到1:100以上。试管凝集试验测定的抗体消长动态与虎红平板凝集结果基本一致。监测结果表明,口服接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗诱导形成的血清抗体水平较低,消失也较缓慢。2.4菌种omp实施嵌合式pcr检测结果从接种疫苗的奶牛群不间断随机采集鲜乳样本90份,按NY/T1467—2007规定的程序操作,针对布氏杆菌OMP25基因进行嵌合式PCR扩增。结果见图2。S2株布氏杆菌活疫苗阳性对照显现一条约420bp的DNA条带,灭菌双蒸水空白对照不显现任何条带,4份被检鲜乳样本显现一条约420bp的DNA带,与预期扩增长度相符合。检测结果证实,免疫奶牛鲜乳样本中能够检出布氏杆菌核酸,检出率为4.44%(4/90)。3布氏杆菌接种疫苗后存在的问题3.1根据我国对牲畜布病疫情的监测结果分析,在20世纪80年代以前,布病疫区主要集中在内蒙古、新疆、青海、宁夏和西藏五大牧区;从20世纪90年代以后,牧区布病疫情依然严重,同时半农半牧区和农区省份的布病疫情明显上升。2008年底,该规模养殖场从天津、唐山、西安大量引进奶牛,与本地牛群混合饲养,导致了布病疫情的流行和蔓延。由于养殖场中奶牛的布病感染率和患病率较高,处于布病感染潜伏期的奶牛数量较大,现阶段对布病重点疫区实施疫苗接种和检疫扑杀的综合防控策略。试验结果表明:对奶牛口服接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗是安全的,免疫接种能够有效控制布病感染牛群发生流产、死胎的症状,减少由此导致的经济损失。但是,疫苗接种只是一种权宜之计,是目前控制重点疫区布病流行的一种方法。由于疫苗接种动物与自然患病动物无法甄别,一旦奶牛群接种活疫苗以后,法定检疫措施严重受阻。另一方面,布氏杆菌是一种慢性胞内寄生感染菌,疫苗活菌在动物体内残存的时间较长,对奶牛群构成潜在的风险。同时,S2株活疫苗对人体具有一定的毒性,对奶牛场的饲养员、繁殖员和兽医形成潜在的威胁。根据内蒙古农牧业科学院防制布病的经验,采用“S2株菌苗口服免疫为主的综合性防制措施”,一年一次即可控制布病大面积流行,连续3年免疫可完全控制布病,通过加强检疫、监测和逐步淘汰,3～5年内可实现奶牛场布病净化的目标。3.3OMP25存在于所有布氏杆菌中,是布氏杆菌主要外膜蛋白成分之一;OMP36主要存在于牛流产布氏杆菌(B.abortus)中,是构成跨膜通道的膜孔蛋白;OMP31主要存在于羊马尔它热布氏杆菌(B.melitensis)中,在绵羊附睾型布氏杆菌(B.ovis)和犬布氏杆菌(B.canis)中表达量也相对较高。按农业行业标准NY/T1467—2007规定的程序操作,针对布氏杆菌OMP25基因进行嵌合式PCR扩增,有利于提高样本中布氏杆菌的检出率,保证布氏杆菌核酸扩增的属特异性。温富勇等采用布病乳汁环状试验抗原检测了86份免疫奶牛的鲜乳样本,未检出布氏杆菌特异性抗体,因此认为乳汁是安全的;风英等采用选择性培养基对鲜乳样本进行细菌学检查,未分离到布氏杆菌,因此认为布病阴性泌乳牛免疫后乳汁无排菌现象;本试验从布病阴性奶牛免疫后采集的鲜乳样本检出布氏杆菌核酸,检出率为4.44%。关于疫苗接种奶牛是否存在乳汁排菌的风险,各地学者持有不同的观点,有不同的报告结果,还有待于进一步深入研究。中国农业大学动物布病防控研究室吴清明指出,在布鲁氏病流行和防控技术研究对策中,应增加动物性食品布病病原体的基本检测项目。近年来随着现代分子生物学技术的不断发展,国内外学者开始将多聚酶链式反应技术(PCR)应用于布氏杆菌核酸的检测。在本试验检出的4份阳性鲜乳样本中,是存在活的布氏杆菌还是死的布氏杆菌,是接种的减毒疫苗株还是流行的野生强毒株,目前尚不清楚,关于鲜乳样本中布氏杆菌的分离培养与种型鉴定正在研究中。3.2奶牛接种布氏杆菌疫苗后,以诱导机体细胞免疫为主