牛胚胎移植的技术要点

牛胚胎移植的技术要点

1胚胎移植的操作环节主要包括选择母乳喂养的母乳喂养牛、超数个母乳喂养牛、同一体和受体的母乳喂养牛、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻保存、胚胎移植、受影响脊柱的妊娠诊断等。要提高牛胚胎移植的成功率,就要从以上各个环节着手,切实做好各项工作。胚胎移植的操作原则:移植中必须遵循移植前后所处环境的同一性。包括:生理上的一致性,即供体和受体牛在发情时间上的一致性和解剖部位上的一致性,即移植后的胚胎与移植前所处的空间环境的相似性。胚胎发育的日龄必须与受体发情排卵期的日龄相一致。胚胎采集和移植的期限(胚胎的日龄)不能超过周期黄体的寿命。因此,通常在供体发情配种后3～8日内收集胚胎和进行移植。移植的胚胎必须经过鉴定,证明是发育正常者。在全部操作过程中,胚胎不应受到任何不良因素的影响。开展胚胎移植必须要有充足的胚胎来源,且质量好。1.1体牛选择1.1.1优良品种供体牛要符合本品种标准,血统、体型外貌和生产性能优良,具有早熟性和长寿性,且遗传性稳定、谱系清楚,无遗传缺陷。1.1.2传染病、传染病、产菌障碍供体牛要体质健壮、肢蹄强健、繁殖机能正常,无遗传病、传染病、难产、流产和繁殖障碍。发情周期不明显的牛、患子宫内膜炎或长期空怀母牛,都不能作为供体。1.1.3年龄合适1.1.4繁殖品质优良具有较高的繁殖力,生殖器官正常,发情周期正常,受胎性好,受胎率及配种指数较好,连续一年产一犊。1.1.5优越性母牛生殖器发育良好,对超数排卵要有良好的反应,且排卵数多,采得的受精卵质量良好。1.1.6温顺要选择性情温顺的母牛作为供体。1.2超排、注射促性腺激素在母牛发情周期的适当时间,注射促性腺激素,使卵巢中有较多的卵胞发育和排卵,这种方法称为超数排卵。在进行胚胎移植时要对供体母牛作超数排卵处理,以便一次取得多枚胚胎。一般认为超排量最好是10个左右,太少会降低胚胎移植的意义,同时胚胎的收集也有困难,超排过多会降低卵子的受精率和收集率。超排处理一般方法为在预计发情到来之前4d,即发情周期的第16d注射促卵泡素或孕马血清促性腺激素,在出现发情的当天注射绒毛膜激素。目前较常采用的几种超数排卵的方法为:1.2.1促其他素—促卵泡素+前列腺素F2a(一般用氯前列烯醇)在发情后的第9～13d进行,肌注促卵泡素50mg,肌注或子宫注入前列腺素F2α4～5mg(子宫注入量减半)。促卵泡素处理采用递减法,以7mg、6mg、5mg、4mg、3mg递减,每日分上、下午2次注射,共连续注射5d。在第3d与注射促卵泡素同时注射前列腺素4～5mg,第5d下午进行第一次输精,第6d上午做第2次输精。1.2.2患者注射前列腺素情况用药时间同上,孕马血清促性腺激素肌肉注1500～3000IU48h后,肌注或子宫注入前列腺素F2a4～5mg。输精时间在前列腺素处理后48h,每隔10～12h输精1次,共输2～3次。1.3冲卵液的采集和保存利用冲卵液将早期胚胎从供体母牛的子宫角内冲出来,并收集于一定的器皿中。胚胎收集方法有手术法和非手术法两种。现普遍采用非手术法。一般在供体母牛发情配种后6～7d内收集胚胎,胚胎处于致密桑椹期和囊胚期。此方法简便易行,对生殖道损伤的危险性小,收集效果比较好。首先将供体牛保定,体位前高后低,便于操作和胚胎冲出。尾根处(第3～4尾椎)剪毛,酒精消毒,注射2%普鲁卡因2～3mL或2%～4%盐酸利多卡因2～4mL等进行尾椎硬膜外麻醉。如牛不安宁可肌注2%静松灵2～4mL。直肠检查卵巢大小、子宫状况,估计黄体数量。清洗外阴部,用消毒液消毒。非手术冲取胚胎所用的冲卵管有二路式和三路式,其不同之处是冲卵液注入和导出的管道,二路式是同一管道,而三路式则各有进出两个管道。另外两种冲卵管都有一注入空气的管道,使之冲卵时,可将子宫角内腔基部固定。导管用直肠把握法从子宫颈导入子宫角。通过气囊导管打入空气,使气囊膨胀以固定导管在子宫角内的位置和防止冲洗液倒流。冲洗液经单路管注入子宫角,然后将冲洗液收集在漏斗形容器内。但气囊充气应适度,每次15～50mL,过于膨胀易损伤子宫内膜,过小则不能固定冲卵管,使子宫留有间隙,冲卵液由阴道流出。一般每侧子宫角需冲卵液500mL,冲卵液温度保持在37℃,冲卵液的导出应顺畅,进出液量要相当,冲洗5～6次。为更多地回收冲洗液,可在直肠内轻轻按摩子宫角。因此,操作时,可用手隔着直肠壁将子宫提高,促进液体回流。收集到的冲卵液,置于37℃无菌间待检。收集胚胎的冲卵液目前多采用改良的杜氏磷酸缓冲液(mPBS),此液可用于冲洗胚胎,也可用于胚胎的保存液和培养液。配制方法简单,成本低,比较适用。冲洗液多数为组织培养液,如林格氏液、杜氏磷酸缓冲液、布林斯特氏液(BMOC-3)和TCM—199等。常用的为杜氏磷酸缓冲液(PBS),加入0.4%的牛血清蛋白或1%～10%小牛血清。布林斯特氏液效果也较好。这两个培养液的成分见表1。冲洗液使用时温度应为35～70℃,每毫升要加入青霉素1000IU,链霉素500～1000μg,以防止生殖道感染。把上述方法所回收的冲洗液于室温或37℃温箱内静置10min。待胚胎下沉后,移去上层液,取底部少量液体移至平皿内,先在10～20倍的解剖镜下检查胚胎数量,然后在较大倍数(50～100倍)下观察胚胎发育情况。把正常发育的胚胎收集于带有密闭盖的玻璃容器内贮存备用。正常发育的胚胎,其中细胞(卵裂球)外形整齐,大小一致,分布均匀,外膜完整。无卵裂现象和异常卵都不能用于胚胎移植。1.4体外受精胚胎的发育时期将收集到的冲卵液静止10～30min,待胚胎下沉后,将上层液吸出,剩余的沉淀液体(约50mL)分别倒入几个检卵杯中,置于体视显微镜下将胚胎检出。检查时要求仔细快捷,不要丢失胚胎,在30min以内检查完毕,以防显微镜光源温度高,而使载物台温度上升,从而影响胚胎质量。将收集到的胚胎,置于高倍镜下观察其形态和发育时期。正常发育的胚胎,卵裂球整齐清晰,大小较一致,分布均匀而紧密,透明带完整,发育速度与胚胎日龄相一致。而没有受精、透明带内卵裂球异常、透明带破损等为不可用胚胎。目前对胚胎的质量鉴定基本上采用形态学的方法,将胚胎分为A级(优秀胚)、B级(良好胚)、C级(一般胚)、D级(不良胚)四个级别。其中,A级和B级胚胎为移植可利用胚胎。A级:发育形态正常,卵裂球致密、整齐、清晰,发育速度与日龄一致。B级:卵裂球稍微不匀,比较致密、整齐,有个别卵裂球游离。C级:卵裂球不十分匀称,变形,发育较慢。D级:卵裂球多数变形、异常,发育缓慢。1.5胚胎移植目前多采用非手术移植法。使用特制的胚胎移植器,通过阴道和子宫颈,将胚胎注入到子宫角的一定部位。其操作过程如下:1.5.1受影响动物的保定消毒同供体牛处理方法。1.5.3侧黄质地,开秋各时间后,认传统发酵液,开颈管将封装好胚胎的细管,开口一端(远离棉芯的一端)向内装入移植器中。直肠检查受体牛卵巢排卵一侧的黄体质地,通过直肠把握子宫颈,将移植器送入子宫颈,再直肠把握子宫角,把移植器轻轻推入有黄体一侧的子宫角,并使其深入到子宫角的大弯部,随后将胚胎推入并缓慢取出移植器。操作时注意动作要稳、快,移植部位要准确,移植后检查细管,看有无胚胎遗漏。如有遗漏,则需重新移植。1.6下一次实施情况胚胎移植后要注意观察供体和受体的健康状况和在预定的时间内是否发情。对于供体牛,在下一次发情即可配种,如仍要做供体则一般要经过2～3个月才可再次超数排卵。对于受体牛,如移植后发情,则表明移植失败,可能胚胎丢失、死亡、吸收或有缺陷,也可能是受体牛的子宫环境不相适宜;如未发情,也要继续观察3～5个情期,并在适宜时期进行妊娠诊断。2影响牛胚胎移植成功率的主要因素2.1冻胚解冻后发育阶段冷冻胚胎质量的判断比较困难。胚胎冷冻前质量好则解冻后也好,移植受胎率也较高。试验中A级胚胎比B级胚胎受胎率高20%。因此,冻胚解冻后必须进行质量鉴定,凡透明带破裂、细胞团分离、颜色发黑的胚胎应弃掉。我们在实际中应用此类胚胎移植9枚,只有1例妊娠。胚胎所处的发育阶段也影响移植成功率。由于移植所用胚胎是通过超排获得的,所以不同胚胎所处的发育阶段存在一定差异,有的处于桑椹胚期,有的处于囊胚期。在移植时选择的受体都处于发情后第7d,致使部分胚胎存在差异。早期囊胚的移植受胎率比桑椹胚高。2.2抗压强度及温度正确的操作是保证胚胎能继续发育的必要条件,其中关键性操作环节有以下几个:一是冻胚解冻温度要严格控制在35℃左右;二是严格按操作程序进行保护液脱洗,保存在细管的冻胚处于高浓度保护液中呈高渗萎缩状态,必须按一定梯度进行脱甘油,至少应进行三个以上梯度操作,每个梯度液中停留5min以上,否则急剧的渗透压变化会导致胚胎中细胞死亡;三是解冻后的胚胎应保持恒温,在移入受体牛之前不能受冷热及强光刺激,要封闭保存;四是胚胎移植到生殖道的位置,因此在移植时,应根据每个胚胎的状态确定输胚位置。2.3受体牛的生殖特性被移植的胚胎能否存活并继续发育,还取决于受体牛的体质及生殖状况。据我们的移植结果,受体牛状况好受胎率较高,育成母牛作受体时受胎率较高;影响胚胎生存的另一个因素是受体牛的子宫内环境。所以在移植时,必须对受体牛进行严格选择。2.4妊娠合并妊娠受胎率气候对胚胎移植的影响主要表现在对受体的影响。根据移植结果,在炎热夏季进行移植受胎率比秋季移植低30%～540%。秋冬两季是进行胚胎移植的