干细胞基础知识

干细胞的概念干细胞是一类含有自我更新和分化潜能的细胞。它涉及胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受多个内在机制和微环境因素的影响。现在人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。最新研究发现，成体干细胞能够横向分化为其它类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。在胚胎的发生发育中，单个受精卵能够分裂发育为多细胞的组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引发组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成年组织的再生是干细胞进一步分化的成果。胚胎干细胞是全能的，含有分化为几乎全部组织和器官的能力。而成年组织或器官内的干细胞普通认为含有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。然而，这个观点现在受到了挑战。最新的研究表明，组织特异性干细胞同样含有分化成其它细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。干细胞含有自我更新能力（Self-renewing），能够产生高度分化的功效细胞。干细胞按照生存阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。1.1胚胎干细胞胚胎干细胞（EmbryonicStemcell,ES细胞）当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（InnerCellMass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞含有全能性，能够自我更新并含有分化为体内全部组织的能力。早在1970年MartinEvans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养。而人的胚胎干细胞的体外培养直到近来才获得成功。进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它含有发育的全能性，能分化出成体动物的全部组织和器官，涉及生殖细胞。研究和运用ES细胞是现在生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。现在许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向实验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益进一步，生命科学家对人类ES细胞的理解迈入了一种新的阶段。在98年末，两个研究小构成功的培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为多个体细胞的全能性。这样就使科学家运用人类ES细胞治疗多个疾病成为可能。然而，人类ES细胞的研究工作引发了全世界范畴内的很大争议，出于社会伦理学方面的因素，有些国家甚至明令严禁进行人类ES细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类ES细胞带给人类的益处远远不不大于在伦理方面可能造成的负面影响，因此规定展开人类ES细胞研究的呼声也一浪高似一浪。1.2成体干细胞成年动物的许多组织和器官，例如表皮和造血系统，含有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着核心的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功效细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。过去认为成体干细胞重要涉及上皮干细胞和造血干细胞。近来研究表明，以往认为不能再生的神经组织仍然包含神经干细胞,阐明成体干细胞普遍存在，问题是如何寻找和分离多个组织特异性干细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞互相作用，控制干细胞的更新和分化。1.3造血干细胞造血干细胞是体内多个血细胞的唯一来源，它重要存在于骨髓、外周血、脐带血中。今年年初，协和医大血液学研究所的庞文新又在肌肉组织中发现了含有造血潜能的干细胞。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效办法。在临床治疗中，造血干细胞应用较早，在20世纪五十年代，临床上就开始应用骨髓移植（BMT）办法来治疗血液系统疾病。到八十年代末，外周血干细胞移植（PBSCT）技术逐步推广开来，绝大多数为自体外周血干细胞移植（APBSCT），在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规治疗，且效果令人满意。与两者相比，脐血干细胞移植的优点在于无来源的限制，对HLA配型规定不高，不易受病毒或肿瘤的污染。在今年初，东北地区首例脐血干细胞移植成功，又为中国造血干细胞移植技术注入新的活力。随着脐血干细胞移植技术的不停完善，它可能会替代现在APBSCT的地位，为全世界更多的血液病及恶性肿瘤的患者带来福音1.4神经干细胞有关神经干细胞研究起步较晚，由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处在初级阶段。理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞功效的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反映，如：给帕金森氏综合症患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经干细胞，可治愈部分患者症状。除此之外，神经干细胞的功效还可延伸到药品检测方面，对判断药品有效性、毒性有一定的作用。事实上，到现在为止，人们对干细胞的理解仍存在许多盲区。年初美国研究人员无意中发现在胰腺中存有干细胞；加拿大研究人员在人、鼠、牛的视网膜中发现了始终处在“休眠状态的干细胞”；有些科学家证明骨髓干细胞可发育成肝细胞，脑干细胞可发育成血细胞。随着干细胞研究领域向深度和广度不停扩展，人们对干细胞的理解也将更加全方面。21世纪是生命科学的时代，也是为人类的健康长寿发明世界奇迹的时代，干细胞的应用将有广阔前景。干细胞应用的基础——调控干细胞的调控是指给出适宜的因子条件，对干细胞的增值和分化进行调控，使之向指定的方向发展。2.1内源性调控干细胞本身有许多调控因子可对外界信号起反映从而调节其增殖和分化，涉及调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因体现的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。（1）细胞内蛋白对干细胞分裂的调控干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功效细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分派和周边环境的作用造成的。细胞的构造蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保存在子代干细胞中。（2）转录因子的调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。例如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4是必需的。Oct4是一种哺乳动物早期胚胎细胞体现的转录因子，它诱导体现的靶基因产物是FGF-4等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周边滋养层的进一步分化。Oct4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团[1]。另外白血病克制因子（LIF）对培养的小鼠ES细胞的自我更新有增进作用，而对人的成体干细胞无作用，阐明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如Tcf/Lef转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef是Wnt信号通路的中间介质，当与β-Catenin形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。2.2外源性调控除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周边组织及细胞外基质等外源性因素的影响。（1）分泌因子间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt信号通路。例如TGF家族中最少有两个组员能够调节神经嵴干细胞的分化。近来研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够增进多个神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF缺失的小鼠体现为干细胞数量的减少，而GDNF的过分体现造成未分化的精原细胞的累积[3]。Wnts的作用机制是通过制止β-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导的转录，增进干细胞的分化。例如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。（2）膜蛋白介导的细胞间的互相作用有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin就是一种介导细胞粘附连接的构造成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前体细胞，脊椎动物的胚胎及成年组织涉及视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统中，Notch信号都起着非常重要的作用。当Notch与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当Notch活性被克制时，干细胞进入分化程序，发育为功效细胞[4]。（3）整合素（Integrin）与细胞外基质整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最重要的分子。整合素与其配体的互相作用为干细胞的非分化增殖提供了适宜的微环境。例如当β1整合素丧失功效时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。另外细胞外基质通过调节β1整合素的体现和激活，从而影响干细胞的分布和分化方向。2.3干细胞的可塑性越来越多的证据表明，当成体干细胞被移植入受体中，它们体现出很强的可塑性。普通状况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。而在某些状况下干细胞的分化并不遵照这种规律。1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，成果发现肌肉干细胞会分化为多个血细胞系。这种现象被称为干细胞的横向分化（trans-differentiation）[5]。有关横向分化的调控机制现在还不清晰。大多数观点认为干细胞的分化与微环境亲密有关。可能的机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反映受到周边正在进行分化的细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反映。干细胞应用平台技术3.1技术原理在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最后衰老死亡。机体在发展适应过程中为了祢补这一局限性，保存了一部分未分化的原始细胞，称之为干细胞（stemcell）。一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞，也能够这样说，这些干细胞充当了分化细胞‘预备队’的角色。在动物体中，多数组织含有干细胞，甚至在进化的早期，最初级的后生动物-海绵也含有称之为`始祖母细胞`的干细胞。干细胞有下列特点：（1）干细胞本身不是处在分化途径的终端。（2）干细胞能无限的增殖分裂。（3）干细胞可持续分裂几代，也可在较长时间内处在静止状态。（4）干细胞通过两种方式生长，一种是对称分裂——形成两个相似的干细胞，另一种是非对称分裂——由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分派，使得一种子细胞不可逆的走向分化的终端成为功效专一的分化细胞；另一种保持亲代的特性，仍作为干细胞保存下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。能够说，干细胞是具多潜能和自我更新特点的增殖速度较缓慢的细胞。公司的干细胞应用平台技术3.2技术方向按分化潜能的大小，干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能性干细胞，它含有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（简称ES细胞），它是从早期胚胎的内细胞团分离出来的一种高度未分化的细胞系，含有与早期胚胎细胞相似的形态特性和很强的分化能力，它能够无限增殖并分化成为全身200多个细胞类型，进一步形成机体的全部组织、器官。另一类是多能性干细胞，这种干细胞含有分化出多个细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制，骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出最少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。尚有一类干细胞为单能干细胞（也称专能、偏能干细胞），这类干细胞只能向一种类型或亲密有关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞。总之，凡需要不停产生新的分化细胞以及分化细胞本身不能再分裂的细胞或组织都要通过干细胞所产生的含有分化能力的细胞来维持机体细胞的数量，能够这样说，生命体是通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及确保持续生长。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等多个生物技术的快速发展，按照一定的目的，在体外人工分离、培养干细胞已成为可能，运用干细胞构建多个细胞、组织、器官作为移植器官的来源，这将成为干细胞应用的重要方向。3.3技术突破近来干细胞的研究有两个重大的技术突破，一是人类胚胎干细胞在体外培养成功。1998年Wisconsin大学的JamesThomson和JohnsHopkins大学的JohnGearhart从人囊胚的内层细胞团中获得胚胎干细胞。他们把胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行了共培养。成果表明胚胎干细胞能够进行长达5个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋养层组织及三种胚层组织的能力。这为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础。另外一种重大突破是成体干细胞的横向分化。1999年Goodell等人用肌肉来源的干细胞在小鼠体内分化成多个血细胞。这表明成体干细胞在一定的微环境的作用下，能够横向分化为需要的细胞和组织，从而起到极其有效的治疗作用。我们所掌握的干细胞技术重要涉及下列两大方面3.4干细胞的分离与纯化干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。另外多个成体干细胞尚有各自独特的标记物，如人造血干细胞体现为CD34+和Thylo而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性[8]。这些特异的标记物可能与其分化调控有关，如上皮干细胞有β1整合素的高体现，而β1整合素可介导干细胞与细胞外基质粘附从而克制其分化的发生。另外干细胞尚有不同于普通分化细胞的物理特性，例如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。运用这些特性及表面标志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。3.5干细胞的体外培养由于干细胞的数目极少，因此需要在体外对干细胞进行非分化性增殖。这需要许多生长因子和间质细胞的共培养。Brustle等人在体外成功地培养了鼠的ES细胞。他们首先把分离的ES细胞在含有FGF2的培养基中培养，随即加入上皮生长因子（EGF），最后在FGF2和PDGF的混合培养基中生长增殖。在这种培养条件下，ES细胞能够保持其分化潜能，如停止供应生长因子，ES细胞会分化为寡树突细胞或星状细胞[9]。不同组织来源的干细胞的培养条件不尽相似。在应用前还需根据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。精确的分化诱导是应用干细胞治疗的基础。这需要对与干细胞发育有关的信号调节及微环境的影响进行具体研究。干细胞技术的市场前景研究干细胞增殖和分化机制的最后目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞能够用于多个疾病的治疗，但其最适合的疾病重要是组织坏死性疾病如缺血引发的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。4.1优点明显应用干细胞治疗疾病较传统办法含有诸多优点：低毒性（或无毒