酵母双杂交系统的研究进展

酵母双杂交系统的研究进展

在生命体内，蛋白质必须通过与其他分子的相互作用来完成生命，这些生物分子的相互作用是生命的基础。研究蛋白质之间的相互作用是了解蛋白质生物学功能的重要手段之一。而利用传统的生物化学方法难以洞察在生物体内瞬间发生的蛋白质之间的相互作用。酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)由Fieldsetal.(1989)发明,利用酿酒酵母GAL4蛋白的特性建立了研究蛋白质间相互作用的全新方法。酵母双杂交系统自建立以来,已经逐步发展成一个较完善的分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统,现又衍生出酵母单杂交系统(yeastone-hybridsystem)、反向双杂交系统(reversetwo-hybridsystem)、双诱饵系统(dual-baitsystem)和三杂交系统(three-proteinsystem)等。酵母双杂交系统自创建以来,已逐步成为研究蛋白质相互作用最重要的手段,揭示了生物体内大量未知蛋白间的相互作用。在植物与病原物识别及抗病信号传导研究中也发挥了重要作用。1结构上的共性Flor(1971)提出的基因对基因学说的分子基础就是配体(ligand)与受体(receptor)的结合,抗病基因的产物作为受体对病原物直接或间接产生的配体或激发子进行识别,进而激活下游的防御反应。目前已克隆了50多例符合基因对基因概念的植物抗病基因,尽管它们所抵抗的病原物的种类千差万别,但在结构上具有一定的共性,如含有亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat,LRR)也支持了配体-受体模式的假说。现已克隆的来自病毒、细菌及真菌的无毒基因(Avr)的序列分析表明,它们彼此之间相似性很小,大部分Avr基因可以编码专一性的激发子蛋白(elicitorprotein),Avr基因的多样性决定了基因对基因抗性进化理论中寄主植物的对病原物的专一性识别。目前与抗病基因相应的无毒基因的克隆,也为研究配体与受体模式提供了可能(Yangetal.,1997;deWitetal.,1999;Ellisetal.,2000andWhiteetal.,2000)。尽管如此,在酵母双杂交系统发明之前,植物抗病蛋白与病原物无毒蛋白之间是否真正发生结合,一直缺乏实验证据的支持。1996年利用酵母双杂交系统在植物抗病蛋白与病原物无毒蛋白相互作用研究领域已取得了重大突破,目前利用酵母双杂交技术已验证了5对抗病蛋白与无毒蛋白之间的直接互作和3对蛋白之间的间接互作。1.1受刺激物和无毒物质之间的直接比较1.1.1pto蛋白的鉴定番茄抗叶斑病的Pto基因是国际上克隆的第一个符合Flor基因对基因学说意义上的植物抗病基因(Martinetal.,1993)。1996年美国科学家利用酵母双杂交系统验证了番茄抗叶斑病的Pto蛋白与其相对应的叶斑病菌Pseudomonassyringaepv.tomato中AvrPto无毒蛋白之间可以发生特异性的结合,同时证实Pto蛋白在204位上的苏氨酸对于与AvrPto蛋白的专一性识别是必不可少的(Tangetal.,1996;Scofieldetal.,1996)。Pto与AvrPto蛋白在酵母双杂交系统中的直接互作结合,首次为Flor基因对基因学说提供了分子水平上的实验证据,对于寄主与病原物相互识别作用机制的研究具有划时代的意义。1.1.2pi-ta与avr-pita蛋白的相互作用与水稻抗稻瘟病基因Pi-ta存在基因对基因关系的无毒基因是Avr-Pita,Jiaetal.(2000)证实Avr-Pita蛋白在酵母双杂交及体外结合实验中均可与Pi-ta蛋白的亮氨酸重复序列结构域(LRD)结合,Pi-ta蛋白LRD结构域或Avr-Pita中单个氨基酸的缺失均可导致蛋白结合的破坏及植物抗病性的丧失。表明Pi-ta与Avr-Pita的直接结合触发了Pi-ta介导的抗病性。1.1.3利用基因组织特点检测细胞中rars1-r-pcr的表达RRS1是从拟南芥中克隆的第一例具有TIR-NBS-LRR结构的隐性抗病基因,但它在转基因植物中表现为显性,将其定义为抗病基因还主要基于以下一些特点:(1)序列与其它抗病基因相似,编码的蛋白属于TIR-NBS-LRR结构;(2)它是SA途径和NDR1信号传导元件所必需的;(3)在携带有RRS1-S的感病品种中导入RRS1-R后,再接种青枯病菌不能发病。Deslandesetal.(2003)研究发现,RRS1抗病蛋白与青枯病菌分泌的typeⅢ效应子PopP2蛋白在双杂交实验中可以发生互作结合,PopP2与抗病蛋白RRS1共定位在细胞核中,并且RRS1在核中的位置取决于PopP2的存在。随后Lahayeetal.(2004)对RRS1与PopP2的识别过程进行了推测,构建了简单的模型。1.1.4烟草n基因的识别烟草N基因与烟草花叶病毒(TMV)之间的关系也符合基因对基因学说,Uedaetal.(2006)利用酵母双杂交及体外结合pull-down方法,验证了N蛋白与TMV的P50结构域可以直接结合,并且这种相互作用必须有ATP的参与。烟草N基因对TMV的识别过程涉及几个步骤,首先ATP与N蛋白形成复合物,N蛋白与p50结合后增强了ATP的水解,形成的ADP/N复合物的空间构像发生变化,便于与下游的信号传导元件相互作用。这一模式构成了理想的蛋白核心“proteinmachine”。1.1.5蛋白序列的可变性分析亚麻抗锈病基因L5、L6和L7与相对应的锈菌无毒基因AvrL567之间存在基因对基因互作关系,Doddsetal.(2006)利用酵母双杂交系统验证了L5、L6和L7抗病蛋白与AvrL567无毒蛋白之间的直接互作,并且它们之间的直接识别作用涉及了抗病基因及无毒基因位点高度的遗传多样性,AvrL567位点基因序列的可变性,决定了与不同抗病基因间识别的专一性。L5、L6和L7与AvrL567之间的关系再次验证了抗病基因与无毒基因协同进化的观点。1.2抗病性蛋白质与无毒蛋白之间的间接关系在多数植物-病原物互作系统中尚未找到抗病蛋白与无毒蛋白直接结合的证据,但已发现有些抗病蛋白与无毒蛋白复合体的形成需要其它蛋白的参与。1.2.2avr9-habs-cf9的互作关系具有胞外结构的番茄抗叶霉病(Cladosporiumfulvum)Cf-9是较早克隆的植物抗病基因,与之相对应Avr9无毒基因也被克隆,但利用多种方法也未鉴定出它们之间的互作关系。Ludereretal.(2001)报道,利用标记的Avr9在番茄中捕捉到了一个高度亲和结合位点HABS蛋白可以与之结合。Avr9-HABS-Cf9三方互作将激活防御反应。HABS蛋白在烟草等茄属植物中也有文献佐证。1.2.3tip蛋白和cp体外蛋白Renetal.(2000)利用酵母双杂交系统,从拟南芥中捕获到与芫菁皱缩病毒TCV病毒外壳蛋白CP结合的TIP蛋白,TIP蛋白属于NAC蛋白家族,参与植物胚的形成及开花过程的调控。CP外壳蛋白与TIP蛋白结合结构域的氨基酸位点突变实验证明,TIP-CP相互作用的丧失直接影响了寄主植物对TCV病毒的抗性。说明抗病基因HRT所介导的对TCV病毒的抗性,需要TIP蛋白与病毒外壳蛋白的结合,这种结合导致了拟南芥防御相关基因的表达。2防御反应生物学中具有结构和功能的动物基植物在与病原物进行识别后,触发不同的早期信号传导,诱导产生的防御反应包括信号传导网络以及快速激活基因的表达,研究发现,植物与动物中的防御信号传导过程中某些因子在结构和功能上具有相似性。2.1番茄抗病性信号的传播方法2.1.1pto基因突变体诱导抗体建构的应途径自1993年第一例来自番茄的植物抗病基因Pto问世以来,陆续从不同作物中克隆的50多例抗病基因,其中来自水稻、大麦和拟南芥的Xa21、Rpg1和PBS1基因是为数不多的几例编码蛋白激酶结构的抗病蛋白。激酶通过磷酸化和脱磷酸化的过程在生物信号传导中扮演着重要角色,对上述具有激酶结构域抗病蛋白信号传导途径的研究,对于解析由抗病蛋白所触发的一系列防御反应途径具有重要意义。利用酵母双杂交系统在以Pto抗病蛋白为核心的信号传导链中先后鉴定出多种重要的蛋白元件,已初步勾勒出了Pto抗病信号传导途径的线条。Zhouetal.(1995)利用酵母双杂交系统从番茄基因文库中“钓”出了与Pto蛋白互作的蛋白Pti1。Pti1属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,已经被证实是Pto蛋白激酶专一性磷酸化作用的底物。Salmeronetal.(1996)利用酵母双杂交系统研究证实了Pto蛋白功能的发挥与另一个抗病蛋白Prf(具有NBS-LRR结构)密不可分,认为Prf蛋白可能是Pto激酶磷酸化的直接作用底物。Zhouetal.(1997)利用Pto为诱饵,利用酵母双杂交系统鉴定了3个转录因子蛋白Pti4/5/6,它们病程相关蛋白(PR)启动子区域的DNA结合结构域,作为Pto蛋白激酶的磷酸化底物,Pti4受乙烯和茉莉酸的诱导,推测Pto蛋白激酶通过与PRbox结合的转录因子的互作调控番茄防御基因的表达(Jiaetal.,1999;Guetal.,2000)。不同蛋白在番茄抗病信号传导中扮演了不同的角色,并通过一系列的串连激活反应最终使番茄产生抗病性,抗病反应的多途径、多分支由此可见一斑。2.1.2cf-9基因的c-末端诱导的诱导效果番茄抗叶霉病(Cladosporiumfulvum)的Cf家族抗病基因Cf-2、Cf-4、Cf-5和Cf-9所编码的蛋白质结构相对简单,不含核苷酸结合位点(NBS),仅有胞外LRR结构域和跨膜结构域TM,但同样具有对病原菌专一性识别及信号传导的功能(Jonesetal.,1994;Thomasetal.,1997;Dixonetal.,1998)。番茄中的Cf抗病基因家族为一系列同源基因,它们分别对携带不同无毒基因的小种产生抗性。位于胞外的LRR结构可能对病菌专一性识别发挥了作用。Cf抗性基因位点由一系列同源基因组成,序列分析比较发现,Cf蛋白的羧基端的序列十分保守,不可能担负对复杂多变的不同病原菌小种的识别任务,所以推测对病原菌的专一性识别可能是由位于细胞外的氨基末端上多变的LRR结构所承担(Ellisetal.,1998;Kruijtetal.,2005;Rivasetal.,2005)。Rivasetal.(2005)利用Cf-9基因位于胞质内的C-端为诱饵,在酵母双杂交系统中捕获到了与Cf-9互作的硫氧还蛋白CITRX(Cf-9-interactingthioredoxin)。病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)实验显示,Cf-9与CITRX之间的结合加速了番茄及烟草中由Cf-9/Avr9触发的过敏性坏死反应,触发了活性氧的积累、蛋白激酶活性的改变及防御相关基因的诱导,增强了不含Cf基因感病寄主对叶霉病菌(Cladosporiumfulvum)的抗性。通过Cf-9的诱导,CITRX扮演了一个细胞凋亡和防御反应的负调控因子,这种反应不受Cf-2的诱导。Cf-9基因的C-末端被CITRX所识别是启动负调控作用的前提,这也是第一篇有关硫氧还蛋白参与植物抗病性调控的报道。Rowlandetal.(2005)利用VIGS技术,在番茄Cf介导的抗性反应中鉴定出了Avr9/Cf-9诱导的蛋白激酶1(Avr9/Cf-9inducedkinase1,ACIK1),ACIK1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是Cf-9/Avr9及Cf-4/Avr4介导的HR反应所必需的蛋白,但在其它的抗性系统,如Pto/AvrPto,Rx/PXV及N/TMV系统中并不需要该蛋白的参与。Nekrasovetal.(2005)根据酵母双杂交实验结果,推测CITRX可能作为一个连接体,在Avr9激活Cf-9胞质结构域时起一个补充作用,在这种相互作用中并不需要CITRX和ACIK1蛋白的催化作用。2.2公体上的基因表达拟南芥的EDS1和PAD4基因编码脂肪酶类蛋白,Feysetal.(2001)年研究发现,它们在抗病基因介导的抗病性反应中起重要作用。EDS1与植物的HR反应有关,水杨酸途径与EDS1和PAD4密不可分。酵母双杂交分析揭示出EDS1能够与PAD4相互作用形成二聚体。免疫共沉淀实验中EDS1和PAD4蛋白在健康的及病原菌诱导的植物细胞中均可发生相互作用。拟南芥的NPR1基因是系统获得性抗病性(systemicacquiredresistance,SAR)及水杨酸(salicylicacid,SA)途径关键的调控因子,为了研究NPR1的功能,Chernetal.(2005)将拟南芥的NPR1基因在水稻中过量表达,转基因水稻对白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的抗性增强,且NPR1在mRNA水平上的积累与抗病性直接相关。在酵母双杂交系统中筛选获得了与NPR1互作的4个属于bZIP家族的蛋白编码基因rTGA2.1,rTGA2.2,rT-GA2.3和rLG2,它们与拟南芥中的TGA2基因的相似率在75%~81%。NPR1与rTGA2.1之间的互作在体外的pull-down实验中得到了进一步证实。这是首例拟南芥NPR1基因可以增强单子叶植物抗病性的报道,说明单子叶和双子叶植物中NPR1介导的抗病信号传导途径具有一定的保守性。拟南芥的基因组含有6个NPR1相关的基因,NPR4与NPR1的同源性只有36%,但是在双杂交系统中,它们能够与一系列相同的TGA转录因子互作。突变试验证实,NPR4是植物抵抗病原物基础防御反应所必不可少的蛋白,在SA与茉莉酸(JA)途径信号传导链中存在一定的交叉(Liuetal.,2005)。Kimetal.(2002)年研究发现,与NPR1互作的TGA5在转基因植物中高水平的表达,使得拟南芥对由卵菌纲真菌引起的霜霉病(Peronosporaparasitica)的抗性大大增强。RAR1是与多种植物抗病基因介导的信号传导途径中处在早期的信号中心,Azevedoetal.(2002)报道RAR1能够与调节细胞循环的SGT1蛋白发生互作,RAR1-SGT1复合物也能够与2个COP9信号元件互作,构成了植物抗病反应的信号传导链。Takahashietal.(2003)年利用酵母双杂交技术又鉴定出一个与RAR1互作的热激蛋白90(heashockprotein90,HSP90),RAR1与HSP90含有AT-Pase的N基端结合,HSP90也能够专一性地与SGT1结合,在拟南芥中HSP90抑制子可以降低HR反应并破坏由RPS2抗病基因介导的对叶斑病的抗性,认为RAR1与SGT1在抗病反应中功能的发挥与HSP90蛋白密切相关。拟南芥的MAP蛋白激酶4(MPK4)是植物防御反应的调控因子,也是调控SA和JA途径防御基因表达所必需的蛋白。Andreassonetal.(2005)对MPK4信号传导研究发现,MKS1是MPK4蛋白的作用底物,在基因组范围内对转基因植物的转录框架进行了全面的分析,发现SA抗病途径完全依赖于MKS1蛋白,MKS1在野生型植物中的过量表达可激活SA介导的抗病反应。利用双杂交技术又进一步捕获到了与MKS1互作的WRKY转录因子WRKY25和WRKY33。MKS1在MPK4调控WRKY转录因子激活的防御反应中扮演着十分重要的角色。目前国际上对植物抗病信号传导的研究主要集中在模式植物番茄和拟南芥中,在其它作物中得研究还十分有限。目前利用酵母双杂交技术在马铃薯和水稻抗病信号传导研究中取得了初步进展。2.3种ap1蛋白互通Fengetal.(2003)从马铃薯抗病资源材料MS-42.3中分离获得了具有体外抑菌活性的抗菌蛋白AP1。采用酵母双杂交系统,以AP1蛋白为诱饵,从MS-42.3cDNA文库中筛选获得了几种与AP1发生互作的,其中4种重要的蛋白有(1)蛋白激酶通过磷酸化将信号传递给下游的元件;(2)ATP合成酶b-亚基,为代谢及信号传导提供能量;(3)乙烯受体蛋白,是乙烯介导的抗病途径中重要的受体蛋白;(4)定位在叶绿体中的铁硫蛋白,早期的胶体金标记定位研究发现,AP1蛋白在叶绿体中有较多沉积。说明AP1蛋白功能的发挥可能涉及与叶绿体中蛋白的互作(冯洁等,2004)。推断AP1蛋白的表达和抗病信号传导与叶绿体蛋白有密切关系,涉及乙烯信号传导途径及与能量代谢有关的蛋白。2.4osk3蛋白激酶在水稻诱导的亚基水稻中目前已克隆了5种SNF-1类蛋白激酶,命名为OSK1-5,它们主要与水稻对环境及营养压力等逆境的反应有关。Kimetal.(2000)年报道,稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)接种水稻后可造成OSK3的强烈表达,说明OSK3蛋白激酶可能参与了植物的抗病性。OSK3蛋白激酶由3个亚基组成,蛋白激酶做为α亚基,β和γ亚基对α亚基起调控作用。以水稻OSK3蛋白激酶为诱饵,利用酵母双杂交系统(1)从水稻cDNA文库中筛选获得了3个与OSK3蛋白激酶互作的β亚基,并克隆了全长基因;(2)发现OSK3蛋白激酶可与2个Ras转录调控蛋白和Myc类转录蛋白之间结合;(3)证明OSK3蛋白激酶与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶互作;(4)捕获了位于OSK3蛋白激酶下游的产生活性氧(ROS)的草酸氧化酶(Fengetal.,2003)。草酸氧化酶可氧化草酸产生H2O2,通过多种方式在植物抗病反应中起到对病原菌产生直接的杀伤作用、使细胞壁糖蛋白形成氧化交联降低细胞壁对病菌产生的降解酶的敏感度及诱导SAR的产生及协调过敏性坏死反应等(Levineetal.,1994;Wuetal.,1995)。因此,草酸氧化酶作为水稻OSK3蛋白激酶的信号传导下游,直接参与水稻的抗病反应。3酵母双杂交无法确定蛋白质互作的最容易取得性酵母双杂交系统以其灵敏性、简便性及广泛性等特点而被应用到诸多方面的研究,但该系统具有其自身的局限性。首先是不能检测所有蛋白间的互作,如(1)不能检测需要3个或3个以上蛋白结合的相互作用;(2)不适合检测涉及膜蛋白的相互作用;(3)有些诱饵蛋白表达后,会对酵母细胞产生毒性,不适合做诱饵基因。尽管存在上述缺陷,但酵母双杂交系统仍是目前所建立的鉴定蛋白质互作最标准的技术。目前在酵母双杂交系统基础上衍生出的其它杂交系统也都有其特定的适用范围。其次是假阳性的存在,即通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真实情况下不一定发生,但目前新系统中由于将多个报告基因组合在一起,可以基本消除假阳性。再次是假阴性的问题,即在生物体内可发生蛋白间的相互作用,但由于种种原因在双杂交系统中观察不到,如(1)有些蛋白之间的互作对载体构建时细小的变化十分敏感,对所采用的双杂交系统有偏好;(2)蛋白在酵母中表达过量时,造成空间的积压,影响了蛋白间的专一性互作;最后,蛋白质间的相互作用还必须结合其它手段加以验证,如体外Pull-down及免疫共沉淀技术(co-immunoprecipitation)等。4价格补充4.1dna地面-基因表达框架基因组学(genomic)蛋白质组学(proteomic)合在一起,统称为omic,它们的结合有助于在全基因组水平上分析细胞信号、基因表达框架及蛋白质-蛋白质相互作用,尽管DNAmicroarray技术已被证实在分析蛋白质的功能、信号传导途径方面具有显而易见的优势,但基因的功能需要通过它们的蛋白产物的活性来加以证实。因此,蛋白的分析也同样被期待可产生许多的信息,将它们组合在一起,构成一个完整的拼图板。双向电泳、质谱及蛋白质微点阵(microarrays)方法相继涌现,使得大规模分析蛋白质信号传导途径成为可能。4.2酵母蛋白互作网络