三维培养基质中肿瘤细胞间充质式迁移和巴特式迁移模式的研究进展

三维培养基质中肿瘤细胞间充质式迁移和巴特式迁移模式的研究进展

间充质式迁移细胞移植不仅是细胞开展各种重要生理活动的基础，也是炎症反应和肿瘤形成等病理过程的重要步骤和重要因素的重要因素。通常细胞迁移由整合素介导,整合素介导细胞黏附于胞外基质(extracellularmatrix,ECM),提供细胞骨架与ECM之间的物理连接,并通过诱发细胞收缩促使细胞极化伸长,同时整合素激活可招募蛋白水解酶聚集于黏附局部,水解酶与ECM相互作用可促使基质纤维降解和重组,从而降低基质对运动细胞的阻力以利导其移动,这就是所谓的间充质式迁移。间充质式迁移的推进依赖整合素介导的黏附和水解酶消除物理障碍的协同作用。离体和在体检测发现肿瘤细胞多高表达基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs),如MMP-2、-9、-13、-15、-17等。然而,Wyckoff等在动物肿瘤模型和人类临床试验中发现使用MMPs和丝氨酸蛋白酶(serineproteases)抑制剂后肿瘤细胞仍保持显著的运动能力,表明ECM降解酶不是肿瘤细胞运动和浸润所必须的,应用高清晰活细胞成像技术发现:当基质水解酶被抑制后,肿瘤细胞可采用另一种非蛋白酶依赖的迁移模式,即通过收缩挤压自身变形来促使细胞穿过胞外基质间隙,这就是所谓的阿米巴式迁移。实验观测发现肿瘤细胞侵袭过程中,两种迁移模式可以相互转化以适应周围环境的变化,两者的灵活转换大大增强了肿瘤细胞的迁移浸润能力,因此也增加了治疗肿瘤时控制癌细胞恶性转移的难度。1肿瘤细胞转移1.1微路径边缘运动非官路径的真理变化检测细胞向邻近正常组织扩散通常对细胞迁移的经典描述包括如下5个步骤:①由肌动蛋白多聚化引起细胞极化和前端伪足扩张;②伪足与ECM配体连接,信号和骨架相关蛋白集中于黏附位点,形成粘着斑;③细胞前端的胞外基质降解;④整合素受-配体结合,诱发肌动蛋白和肌球蛋白Ⅱ(myosinⅡ)交联与收缩;⑤细胞体向前滑动,尾部回缩。进行间充质式迁移的细胞遵循5步迁移规则,其中有两个环节至为关键,即整合素的胞内结构域可诱发骨架装配和收缩促使细胞形成梭形,并在细胞两端产生高收缩力,同时其胞外结构域可招募MMPs在局部聚集,MMPs一是通过降解ECM为肿瘤细胞向前运动清除物理障碍,二是切断受-配体连结利于尾部回缩,从而构成间充质式迁移的限速步骤。应用高精度多模态显微镜观察MMPs如何促进癌细胞向邻近正常组织扩散过程发现:MMPs对胶原纤维进行剪切并将它们重新排列为平行的纤维束,单个细胞就沿这些微路径在ECM上迁徙,在微路径边缘运动的细胞可使基质纤维向外扩展而产生更大的允许群体细胞迁移的管状路径,当更多细胞相继沿着新产生的路径运动时,由前自后形成接触引导式的群体迁移现象。整合素介导的黏附作用是细胞进行间充质式迁移的基础,因而整合素的代谢过程也会极大地影响细胞的间充质式迁移行为。Caswell等监测到整合素的运输代谢过程,整合素二聚体不断从质膜被胞吞到内含体组件,通过微管运输再胞吐到细胞表面,从而完成胞吞-胞吐循环,这是一个高效的过程,质膜池的整合素仅需30min就能循环一次。整合素的这一循环利用机制,使细胞尾部脱黏附与前端新生黏附位点间的整合素以更替相续的方式来支持细胞的运动行为。最近Eileen等的研究显示:整合素循环与整合素-骨架分子路径上的机械力传导有关,因整合素耦联胞内-外骨架,使细胞运动过程中其骨架动力学变化产生的机械力经由整合素-骨架传导的同时,可通过影响整合素分子内的构象改变来调控局部黏附复合物的结合亲和力,即稳定黏附与快速释放可能依赖骨架应力的作用。高方向性是细胞间充质迁移的另一个鲜明特征。在持续方向上迁移的细胞需要形成占显著优势的伪足,当迁移细胞受到趋化剂或ECM的刺激后,在接触面上将局部信号放大,这些信号调节肌动-球蛋白骨架重组,使细胞形态极化并产生伪足扩张。在与基质相互作用的黏附细胞中,Rho促进整合素β1与基质快速结合,并稳定整合素-基质的连接,增加黏附斑的面积和力量。由于黏附斑的形成和翻转发生在10～120min的时间尺度内,最终导致细胞在三维基质内的迁移具有高的方向持续性和相对较低的迁移速率(0.1～0.5μm/min)。1.2细胞内部组织化学以上5步迁移模型并不能覆盖所有的迁移形式,在体或三维培养环境中细胞还会以另一种更有效的方式即阿米巴运动来迁移。细胞模仿单个阿米巴Dictyosteliumdiscoideum的运动特征。Dictyostelium是一种椭圆形细胞,通过一种或几种非-整合素受体以较低结合力与胞外配体结合,且具有高速变形性,在几秒内就可通过形变来移动位置。在高等真核细胞中,阿米巴运动通常发生在造血干细胞、白细胞和一些肿瘤细胞中,这些细胞通常以与基底较弱的短暂黏附来驱动这种快速“爬行”的运动方式。最近,Pinner等在在体实验中观察到了类似的运动,他们将转染表达荧光标记的癌细胞注射到缺乏免疫力的裸鼠皮下或乳房脂肪垫下,2～4周后用长波长的多光子活体显微镜观察癌细胞在体内的运动特征,发现部分运动的肿瘤细胞能快速改变形状和方向,并以15μm/min的高运动速度迁移。进行阿米巴式迁移细胞的骨架构象多为皮质层环形结构,皮质骨架环形成由相关骨架结合蛋白在皮质层的定位诱导。细胞形变是由皮质层纤维状肌动蛋白收缩产生的,它可以在缺少成熟黏附斑和应力纤维的情况下,调节细胞运动,同时为细胞提供一定的刚度。通常以阿米巴模式侵袭的细胞都具有高肌动-球蛋白收缩水平。Rho和ROCK(Rhoassociatedcoiled-coilformingkinase)是肌动蛋白动力的重要调节子,ROCK接受Rho转导的活化信号,激活后的ROCK通过直接磷酸化肌球蛋白轻链(myosinlightchain,MLC)和失活肌球蛋白轻链磷酸酯酶(myosin-light-chainphosphatase,MLCP),引起胞内MLC磷酸化水平提高,从而产生肌球蛋白Ⅱ介导的肌动蛋白收缩。2不同迁移细胞的基质结构间充质式迁移多为整合素依赖的群体迁移,细胞有着伸长的表型,高方向性和低速率是其明显特征,同时需要水解酶参与对基质重组和降解。而阿米巴式迁移的细胞则以一种非整合素依赖的,无典型黏附斑和基质结构重组,但更快速、灵活的方式运动。虽然肿瘤细胞迁移过程中其迁移运动会遵循一定的模式,但其迁移模式不是固定不变的,肿瘤细胞的自身状态和微环境的变化都会对其迁移模式产生很大影响,改变某些因素会引起肿瘤细胞运动状态在不同迁移模式之间转换。2.1之间充质-阿穆伯塔-马的变换mat2.1.1表面活性剂抑制侵袭伪足(podosome/invadopoia)是富含丝状肌动蛋白的亚细胞突触,其中包含跨膜基质金属蛋白酶(membrane-typematrixmetalloproteases,MT1-MMP),MT1-MMP是肿瘤侵袭的关键酶,能水解细胞表面蛋白和降解ECM组分,并作为proMMP-2的特异活化剂,而在肿瘤细胞的侵袭伪足处聚集。Wolf等在体外三维胶原基质上研究过量表达MT1-MMP的HT1080纤维肉瘤细胞的侵袭行为,发现不存在蛋白酶抑制剂时,HT1080/MT1-MMP依赖整合素黏附到胶原基质上,通过蛋白酶的水解作用在基质上产生管状通路并在其中迁移,这与典型的间充质迁移模式一致。但是,在加入水解酶抑制剂后,细胞转为与基底较弱短暂黏附的椭圆形,这时通过产生足够的肌动-球蛋白收缩力推开基质纤维以穿过ECM,在不依赖水解酶的作用下挽救其迁移行为。另外,用广谱MMP抑制剂GM6001处理皮肤伤口处的成纤维细胞发现:成纤维细胞在朝向伤口的迁移中表现出圆形的阿米巴表型,虽然引起重组伤口的收缩能力被极大地削弱,但它们保留了向富含纤维蛋白的受损基质渗透的能力。应用高清晰活细胞成像技术发现:当基质水解酶被抑制后,在迁移的MTLn3E细胞中,MLC在细胞侵袭端周边排列并朝向迁移方向,MLC分布和磷酸化调节与肿瘤细胞侵袭能力提高直接相关。但水解酶抑制剂是如何干扰整合素和骨架动力调节,从而开启间充质运动朝向阿米巴运动转换的机制仍不是很明了。2.1.2细胞回缩变圆黑色素瘤细胞依赖β1整合素呈多细胞聚集式侵袭,前导细胞优先表达β1整合素并在细胞前端聚集,干扰β1整合素的功能可诱发形成两个或几个反向的前导端,这时细胞聚集被破坏,各自分离的单个细胞以不依赖β1整合素的阿米巴运动模式进行迁移。通常在不干扰细胞收缩的情况下,以减少细胞黏附力促进细胞变圆并朝向阿米巴运动模式转换的方法包括:敲除或抑制β1整合素内源基因表达,或应用抗体作用下调β1整合素介导的黏附,通过显性负相关的多肽来干扰胞质β1整合素结构域。Maddox等用整合素抗体或小分子抑制剂屏蔽整合素的作用后,无论是呈纺锤形的成纤维细胞、扁平状的内皮细胞或多种肿瘤细胞均表现为细胞回缩变圆,迁移速率改变。另外,应用流式细胞术分析HT1080细胞表面整合素的表达发现:阿米巴样细胞表面较间充质样细胞表面的α2β1整合素量减少。2.1.3纤维细胞的迁移实验研究发现:ROCK激活可增加肌球蛋白Ⅱ介导的肌动蛋白收缩能力和稳定性。Burrideg等观察到当组成性激活Rho的效应子ROCK后,HT1080纤维肉瘤细胞以阿米巴迁移方式穿过厚的三维基质胶。Rosel等以非转移细胞K2做对比,用免疫荧光染色检测丝状肌动蛋白和P-MLC分布,结果发现在高转移的A3细胞中P-MLC和皮质层丝状肌动蛋白有86%±8%的共定位,K2细胞只有35%±10%的共定位。转移细胞通过上调Rho/ROCK信号,导致骨架动力学变化加剧,使用共聚焦牵引力显微镜检测发现:转移细胞中MLC向前导端定位,同时细胞前缘牵引力增加,这些改变支持细胞在三维胶原基质中以阿米巴式迁移侵袭。2.2间充质迁移抑制剂通过siRNA库来寻找与阿米巴运动相关的鸟苷酸交换因子(guanosinenucleotideexchangefactors,GEFs)靶目标,发现DOCK10(Cdc42GEFs)为阿米巴迁移的重要调节子,激活的Cdc42诱导间充质-阿米巴式迁移转换,并增加细胞侵袭。沉默DOCK10表达诱导阿米巴-间充质式迁移转换,并同时减少MLC2磷酸化和增加Rac1激活,删除DOCK10和Rac1表达抑制阿米巴和间充质迁移并降低侵袭。Sahai等研究表明细胞通过RhoA/ROCK调节肌动蛋白骨架保持阿米巴侵袭表型。Torka等用TranswellChambers研究不同抑制剂对肿瘤细胞表型和侵袭能力的影响发现:当间充质式迁移表型和阿米巴式迁移表型各占50%时,用MMP抑制剂cocktail处理后,MDA-MB231表现出63%的阿米巴表型,38%的侵袭能力被抑制,而用ROCK抑制剂Y27632处理后,MDA-MB231细胞展现出更多的间充质式迁移表型(71%),即部分实现阿米巴式迁移向间充质式迁移的转换,但对其侵袭能力没明显影响。另外,Rosel等在研究ROCK抑制剂对细胞迁移的影响时发现:ROCK抑制作用增强K2细胞体外侵袭力,并伴随MMP-2提高(1.7倍)。Baum等认为进行间充质式迁移时,细胞表达β1和β3整合素上调,β3整合素与MMP2结合,可使MMP2一直处于活性态,MMP2激活又会促进MMP2分泌增加,即蛋白水解酶活性变化与其分泌表达的正反馈调节对肿瘤细胞迁移表型维持有支持作用。3直接调节间充质式迁移实验观测显示细胞形状变化在迁移模式转换中十分明显,细胞形状和运动改变取决于细胞骨架动力学的直接变化,而骨架解聚与聚合、收缩与重排等动力学变化在很大程度上受Rho族蛋白的调节,Rho族蛋白在其调节子和效应器的作用下可对肿瘤细胞运动行为产生不同影响。ROCK和mDia(mammalianhomologofDrosophiladiaphanous)是Rho的两个重要效应器,Rho-ROCK与Rho-mDia1信号通路间存在拮抗作用,高水平的GTP-Rho可同时激活ROCK和mDia1,ROCK一方面提高肌动球蛋白的收缩性,一方面强烈抑制Rho-mDia1激活Rac,从而抑制间充质式侵袭行为;低水平的GTP-Rho优先走Rho-mDia1信号通路激活Rac,活化的Rac又抑制ROCK活性,导致阿米巴式迁移能力下降。因此Rho-ROCK与Rho-mDia1信号的相对活性水平对决定肌动-球蛋白束装配成张力丝支持间充质式迁移,或装配成皮质收缩环结构支持阿米巴式迁移至关重要。如前所述皮质收缩环及其高收缩活性是肿瘤细胞进行阿米巴式迁移的基础,ROCK可激活肌球蛋白诱导肌动-球蛋白成束,并提高肌动-球蛋白的收缩。3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶(PDK1)是Rho/ROCK保持皮质肌动蛋白活性的重要调控子,PDK1作为ROCK1的正性调节器在质膜处与其负性调节器RhoE竞争,推动肌动-球蛋白重组,促使阿米巴式迁移。MLC2的磷酸化和P-MLC2的去磷酸化活性决定肌动-球蛋白的收缩活性。Rho激活ROCK,ROCK除了直接参与肌球蛋白轻链激酶(myosin-light-chainkinase,MLCK)对MLC2的磷酸化作用外,ROCK还通过抑制MLCP的活性抑制P-MLC2的去磷酸化,提高肌球蛋白ⅡATPase活性,使肌球蛋白Ⅱ更有效地与丝状肌动蛋白作用,从而促进细胞收缩。此外,Rho/ROCK1也能通过激活Rac的GAP(GTPaseactivatingproteins,GAPs)ARHGAP22,导致细胞中Rac-诱导的层形足板的形成受损,从而抑制间充质式迁移的侵袭。在间充质式迁移的细胞中Rac是层形足板形成的关键调节子。其激活与mDia有关,mDia属于forming-homology(FH)蛋白家族,拥有三个亚基(mDia1-3),通过催化肌动蛋白成核和聚合产生长的丝状肌动蛋白。Rho-mDia1信号通过Src激活和磷酸化形成Cas/Crk/DOCK180复合物激活Rac,活化的Rac可作用于下游底物Arp2/3复合体,调节细胞前缘片状伪足丝状肌动蛋白的聚合;Rac也可作用于下游靶分子PAK激活LIMK,抑制cofilin诱导的肌动蛋白解聚,而在细胞前沿增加聚合态的肌动蛋白,cofilin是ROCK的下游分子,通过调节肌动蛋白成核、剪切、解聚等活动来促进肌动蛋白循环,LIMK-1磷酸化cofilin使其失活,磷酸酶SSH1L使其恢复活性,LIMK1和SSH1L介导的cofilin活性时空调节对于趋化诱导极化片状伪足形成和细胞方向性迁移非常重要;此外,Rac也能通过局部产生4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositolbisphosphate,PIP2)使肌动蛋白丝去帽,产生肌动蛋白聚合的额外位点,层形足板中的微丝骨架是间充质式迁移进行的基础。与Rac诱导细胞片状伪足形成的机制相同,Cdc42激活其靶蛋白N-WASP,并与profilin、G-丝状肌动蛋白、Arp2/3形成复合物,通过促进肌动蛋白丝的聚合与抑制肌动蛋白丝的解聚,诱导丝状伪足的形成。另外,Cdc42也能通过下游效应器N-WASP和PAK2提高肌动球蛋白的收缩,抑制Cdc42的调控基因DOCK10或下游效应器N-WASP和PAK2,导致阿米巴侵袭向间充质侵袭转换。4mmp抑制剂的耐药机制和治疗药物的优化肿瘤细胞的侵袭行为是其恶性转化的标志,间充质与阿米巴两种迁移模式的灵活转换大大增强了肿瘤细胞的迁移浸润能力。对临床治疗而言,如何有效抑制肿瘤细胞的恶性转移和防止手术后残余肿瘤的扩散始终是治疗策略的核心目标,因此弄清楚肿瘤细胞不同侵袭模式的分子特征可为抗侵袭或抗转移治疗提供指导。在动物模型中MMP抑制剂可显著抑制肿瘤的进展,但在人类胃、胰腺、前列腺和肺癌的临床治疗效果并不令人满意。究其原因应是多方面的:一是MMPs家族成员众多,目前已发现30多种酶,它们的结构和功能存在不同程度的重叠,故MMP抑制剂因缺乏特异性可导致一些不可预测的副作用:如用广谱抑制剂抑制胶原酶-1可引起关节硬化强直和上肢疼痛等;二是不同类型的肿瘤细胞对蛋白酶抑制剂敏感性不同,Sahai等发现BE结肠癌和SW962鳞状细胞癌对MMP抑制剂敏感,但A375m2黑素瘤细胞和LS174T结肠癌细胞对MMP抑制剂不敏感(阿米巴式迁移)。Wolf等发现对HT1080纤维肉瘤细胞施加MMP抑制剂后,可导致细胞由间充质迁移模式向阿米巴迁移模式转换,从而逃脱MMP抑制剂的药理学作用。正如Decaestecker等所指出:较少水解酶与胞外骨架重组参与的阿米巴迁移模式增加了肿瘤细胞在较松连接组织中的随机扩散机会,因此实施对间充质式迁移和阿米巴式迁移的联合抑制有望能有效阻止肿瘤细胞的侵袭。另外,如何通过整合素受体状态和蛋白酶表达及ROCK的活性变化来合理评价恶性肿瘤临床病例的迁移模式,并针对不同迁移模式给患者最佳治疗组合,将是指导个性化治疗方案实施的关键。同时,还有一项刻不容缓的工作就是设计快速有效的临床试验模型来检测治疗效果,如目前用于临床试验第一阶段的Src激酶抑制剂,体外实验表明它是一种有效的抗肿瘤侵袭因子,后一阶段的工作不仅需要在侵袭转移临床模型中进一步检测验证,而且更需要进行体内实时监测,并评估抑制剂分别对间充质式迁移与阿米巴式迁移的抑制效率。5间充质式迁移模式与黏附斑织物的性质随着体外研究模型和体内实时监测技术的不断完善,对肿瘤细胞不同迁移运动模式的特征及一定条件下迁移模式间相互转换的诱发因素的研究取得了重大进展,但在肿瘤迁移和侵袭过程中其迁移模式转换的精细调节机制还有待于进一步深入研究。肿瘤细胞转移是一个涉及多环节和多步骤的复杂过程,肿瘤细胞浸润转移既涉及从原发灶向周边扩散,又涉及肿瘤细胞渗出血管内皮和趋化性通过邻近胞外基质等一系列连续过程,这些体内微环境具有不同的力学特征