丹参提取液体外抑菌作用研究

丹参提取液体外抑菌作用研究

丹参是嘴唇科的一种植物。它是嘴唇科的一种大鼠尾草科植物。它具有活血化瘀、解毒、凉血、消肿、止痛等功效。丹参主要含有脂溶性和水溶性两类成分,其95%乙醇提取物主要是脂溶性的丹参酮类成分。研究表明,总丹参酮对金黄色葡萄球菌及耐药菌株链球菌、分枝杆菌等均有明显抑菌作用。本实验利用丹参提取液对几种常见菌进行体外抑菌试验,考察丹参的抑菌活性。1材料和机器1.1丹参莒县库山产紫花丹参的干燥根及根茎,经鉴定为SalviaemiltiorrhizaeRadixetRhizoma。1.2菌种和培养基大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102],金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003],枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501],铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104],短小芽胞杆菌(Bacilluspumnilus)[CMCC(B)63202],白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001],以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。1.3培养基和培养基MH肉汤培养基(批号080428),营养肉汤培养基(批号080513),改良马丁培养基(批号090202),营养琼脂培养基(批号080709),玫瑰红钠琼脂培养基(批号080611),以上培养基均购于北京三药科技开发公司。1.4仪器2方法2.1丹参醇提取溶液的制备方法2.1.1号提取液及号提取液的制备精密称取2份,每份8g,分别加95%乙醇100mL。其中1份加热回流提取1h,放置至室温,过滤,滤液浓缩并转移至25mL容量瓶中,加95%乙醇稀释至刻度,摇匀,为Ⅰ号提取液,备用。另1份超声提取30min,过滤,滤液浓缩并转移至25mL容量瓶中,加95%乙醇稀释至刻度,摇匀,为Ⅱ号提取液,备用。2.1.2标准溶液及提取液的配制其中1份加热回流提取1h,放置至室温,过滤,滤液浓缩并转移至25mL容量瓶中,加70%乙醇稀释至刻度,摇匀,为Ⅲ号提取液,备用。另1份超声提取30min,过滤,滤液浓缩并转移至25mL容量瓶中,加70%乙醇稀释至刻度,摇匀,为Ⅳ号提取液,备用。2.2超声提取液制备精密称取2份丹参干燥粉末,每份8g,分别加水50mL。其中1份加热回流提取1h,放置至室温,过滤,滤液浓缩并转移至25mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,为Ⅴ号提取液,备用。另1份超声提取30min,过滤,滤液浓缩并转移至25mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,为Ⅵ号提取液,备用。以上Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ号丹参提取液的浓度均为320mg/mL。2.3菌悬液的制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞杆菌、短小芽胞杆菌、白色念珠菌的斜面新鲜培养物1白金耳,置营养肉汤培养基中,36±1℃培养24h,白色念珠菌置23~28℃培养48h,培养后,用灭菌生理盐水10倍系列稀释成103~105个/mL的菌悬液。2.4培养基和培养用MH肉汤培养基将Ⅰ、Ⅴ号丹参提取液稀释为A~F一系列对倍稀释液,其浓度分别为320,160,80,40,20,10mg/mL。各取1.0mL分别加于试管中并加入菌悬液0.1mL,置36℃±1℃培养24h,白色念珠菌置23~28℃培养48h,同时做菌液对照(培养基中加入相同量的各菌液)和空白供试品(取各F号供试液不加菌液)同时培养。取出各培养管,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞杆菌、短小芽胞杆菌划营养肉汤琼脂平板,白色念珠菌划玫瑰红钠琼脂平板。分别置36±1℃和23~28℃培养,观察结果。2.5ph值对抑菌圈直径的影响2.5.1取一定量Ⅰ号提取液分别用紫外照射、0.22µm薄膜过滤、115℃高压灭菌30min,制备供试液ⅠA、ⅠB、ⅠC。另取一定量Ⅰ号提取液(pH5.0),加氢氧化钠试液调pH值分别为7.0(ⅠD)、8.0(ⅠE)的供试液。2.5.2将2.3中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的菌悬液分别用棉扦涂抹于MH营养琼脂平板上,每一平板培养基内放入6个牛津杯,在牛津杯中分别加入Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ,ⅠA,ⅠB,ⅠC,ⅠD,ⅠE号供试液,37℃培养16h,测量抑菌圈直径,观察结果。以上试验每1供试液重复2次,试验重复3遍,同时用95%乙醇做阴性对照。2.6统计处理方法实验数据采用方差分析,F检验。统计学处理均采用SPSS统计软件完成。3结果3.1mic的测定Ⅰ号丹参提取液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的MIC均为20mg/mL,对枯草芽胞杆菌的MIC为40mg/mL,对铜绿假单胞杆菌、短小芽胞杆菌的MIC均为80mg/mL,但Ⅰ号丹参提取液在所试的浓度范围内对白色念珠菌无抑菌作用;Ⅴ号丹参提取液对金黄色葡萄球菌的MIC为80mg/mL,而在所试的浓度范围内对其它菌均无抑菌作用。见表1。3.2号创气液抑菌效果测定丹参不同提取方式制备的供试液,对金黄色葡萄球菌的抑菌活性有显著性差异(F=23.726,P<0.05),Ⅰ号提取液抑菌效果优于其他组;Ⅵ号丹参提取液在本实验条件下无抑菌作用;95%乙醇无抑菌作用。见表2。3.3菌的抑菌活性丹参提取液分别经紫外照射、0.22µm薄膜过滤、高压灭菌后,对金黄色葡萄球菌的抑菌活性无显著性差异(F=0.752,P>0.05)(见表3)。丹参提取液由pH5.0分别调节为pH7.0、pH8.0后,对金黄色葡萄球菌的抑菌活性也无显著性差异(F=2.233,P>0.05)(见表4)。4讨论4.1杆菌的抑菌作用试验结果表明,丹参醇提液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞杆菌、短小芽胞杆菌均有抑菌作用,尤其对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌抑菌作用较强,这与相关报道一致。4.2抑菌效果的测定本试验考察了分别以乙醇、水为溶剂的回流、超声提取方式对丹参液的抑菌效果,结果回流醇提丹参液的抑菌效果较好。因此,丹参抑菌的主要成分为脂溶性成分。以水为溶剂回流的提取液,对金黄色葡萄球菌也有一定的抑菌作用,这可能是水溶性成分由于