药物毒理学的研究与应用

药物毒理学的研究与应用

近年来，随着人类组排列的完成，以基因组学技术为代表的生命科学技术的快速发展，以及转移和合成化学技术对药物研发领域的影响，导致了药物研发模式的重大变化。现代药物组合化学、化学生物学与活性筛选技术迅速发展,使在较短时间内合成大量候选化合物并评价其药理活性成为可能。为适应药物研发模式的改变,药物毒理学研究的思路也在发生着变化。现就药物毒理学研究的思路和一些新技术作简要论述。1药物毒性研究的概念转变1.1发现毒物的毒力新药研发是一项耗资大、周期长的系统工程,安全性和有效性是决定新药研发成功与否的关键性因素。据美国FDA估计,约有30%的新药因安全性因素而导致研发失败。如果能及早发现药物毒性,淘汰不宜开发的药物可避免更大的经济损失。最初,药物毒理学家在药物开发中的作用仅局限于中后期参与药物的临床前毒性评价,不能积极主动地指导和协调新药开发的前期工作,导致许多有很好开发前景的药物由于毒性或其他安全性因素而中途夭折;即使经过结构改造后最终进入医药市场,也不可避免地造成人力资源的巨大浪费,人为地拉长了新药研发周期。因此,为了提高新药早期毒性的科学预测性,西方各大制药公司将过去的临床前和临床安全性评价的药物毒理学早期研究模式转变为在新药发现阶段即对新化学实体(NewChemicalEntities,NCEs)进行毒理学与药理学、药效学、药动学相结合的筛选和优化的发现毒理学研究模式,通过综合分析药效学、药动学及毒理学的各项指标,评价系列NCEs的研发前景,从中筛选出毒性小的候选新药进行后续研究。其研究的思路是将药物毒理学研究贯穿于新药发现、临床前安全性评价、临床试验和上市后监督与跟踪的整个过程中,这就是发现毒理学研究的产生背景。在药物开发过程中,通过毒性筛选技术发现新化合物有明显的毒性作用时,则会终止进一步的研发。但这时毒理学的主要任务是要了解终止开发的原因,探讨毒性作用机制,避免重复开发有类似毒性的产品。此时,有必要采用发现毒理学技术(组学技术、转基因技术等)对化合物进行快速、全面、系统的毒理机制预测研究。建立以作用机制为基础的模型,以便用来检测和预测类似的毒性效应。研究确定化合物毒性效应的生物学机制,有助于建立识别潜在人类毒性的临床指标,更好地评估人类危险度;而探明化学物的化学作用机制,则有助于在产品开发过程中淘汰有潜在毒性的化学物,或者是删除化学物中有潜在毒性的功能基团。1.2新技术的研发必须符合临床试验的原则伴随发现毒理学在新药毒理学研究中的发展,新药毒理学研究的模式也逐步从传统的临床前评价、临床评价的两阶段模式,向早期发现毒理学(包括体外短期毒性筛选﹑组学技术﹑生物信息学技术)、临床前评价、临床评价、上市后监督再评价的四阶段全程评价模式转变,形成了全程式新药安全性研究评价的新模式。全程式新药安全性研究评价新模式的首要特征是重视发现毒理学在新药开发中的作用。发现毒理学是指在创新药物的研发早期,即对所合成的系列NCEs进行毒性筛选,以发现和淘汰因毒性问题而不适于继续研发的化合物,指导合成更安全的同类化合物。其具体实施过程为:在化学家合成出一系列NCEs后,药理学家和毒理学家同时采用快速、低耗、高通量的筛选系统,进行NCEs的药理活性和毒性的同步筛选,找出真正有苗头的候选化合物。在此基础上,确定NCEs的临床前毒性作用机制和定量构效关系(QSAR),以此指导化学家合成毒性较低的系列化合物;最后毒理学家再按照该类化合物的毒性机制选出合适的体内动物实验模型,对有苗头的化合物做体内毒性评价。按照上述药物开发模式可尽快得到药物的安全性资料,并且这些资料与后期临床试验的相关性更为紧密。这样使药物研发的费用降低,周期缩短。以往的经验表明:在临床前阶段,毒性问题是开发失败的主要原因,约占全部开发失败的40%;临床前阶段之后,临床药效则成为开发失败的重要原因,约占Ⅲ期临床试验失败的75%。经过10多年的实践,人们愈来愈认识到发现毒理学可以给制药企业带来的巨大经济效益。在药物发现阶段,若存在多种具有良好前景的候选新药,要尽早发现潜在的毒性问题,同时确定其药效和安全性;这样既提高了开发效率、降低了开发失败的风险,又不增加额外的资源消耗。全程式新药安全性研究评价新模式的第二个突出的变化是强调新药上市后的监督再评价。近年来,有多种药物因特异质药物反应而撤出市场或被迫标识“黑框”警告,如抗糖尿病药曲格列酮、抗肝炎药非阿尿苷等。这些特异质药物反应具有以下特点:①不可预测性。②发生率低,约占全部用药患者的0.01%~5%。③无明显的剂量反应关系。④难以用实验动物模型复制。⑤一般在药物上市后才被发现。因此,FDA在批准某些药物上市时,明确要求进行上市后的Ⅳ期临床试验,以便发现那些因发生率过低、在Ⅲ期临床试验中无法发现的毒性反应。强调新药上市后的监督再评价的原因还可以进一步进行新药上市前未能进行或未完善的研究,如特殊人群(老年人、儿童、肝肾功能异常者等)的安全性研究;药品间相互作用的研究;长期用药(甚至终身用药)研究等。还可以提供某些老品种药继续使用、减量生产或淘汰的科学依据。并在进行新老品种药物的对照研究时,根据其优缺点差别提出合理用药方案,指导临床合理用药。还可以解释在临床试验与临床应用中发生的差异:因为仅靠I~Ⅳ期临床试验并不能全面评价临床新药罕见的不良反应和安全性。全程式新药安全性研究评价新模式的第三个特征为强调不同阶段毒性研究之间的联系和参照。一方面前期的毒理学研究结果对后期研究的设计如动物种属的选择、检测指标的确定、特异性标志物的选定等提供依据;另一方面,后期研究的结果则可以确定所发现的毒性是种属特异性的还是具有普遍意义。2研究药物专利的量化研究利用现代生命科学的新进展,建立和应用新药临床前安全性评价和毒理学机制研究的新技术、新方法和新模型是当今国际上新药研发的新趋势。可以采用这些技术研究靶器官毒性作用机制及定量构效关系;研究药物体外替代性毒性筛选模型;研究适合新型药物如基因治疗、转基因药物、新型生物制品等和传统医药的临床前安全评价模型和方法;在新药研发和临床前安全性评价研究过程中,应用一些新技术、新方法和新模型,能大大地提高新药研发效率、缩短预防周期和提高成功率。现将最近发展起来的发现毒理学技术和转基因技术作简单介绍。2.1基因缺失检测药物毒性作用机制尤其是慢性毒性药物作用机制异常复杂,找出药物毒性作用的靶点尤为困难。基因敲除技术为阐明某些基因或生物大分子在药物毒性发生中的作用提供了新途径。如通过敲除胚胎干细胞中某些与胚胎正常发育(如SonicHodgehog,PLC)、男性不育(GAPD2S)或者正常免疫功能(如生长因子、干扰素)有关的基因,目前已成功地阐明了类视黄醇致畸、表氯醇致男性不育及5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸致骨髓抑制的机制。与传统的规范性动物致癌实验相比,用转基因动物进行致癌性筛选的优越性显而易见。应用现有的转基因动物进行致癌性筛选,可以缩短时间和减少费用。目前已建立的检测模型或研究模型有:①过量表达癌基因的转基因动物模型,如TG,AC小鼠,HK-fos转基因小鼠等。②基因敲除动物致癌检测模型。③转基因动物用于生殖毒性研究。所有这些都是在产品研究开发的早期或中期,用转基因动物进行致癌性筛选的优越之处。2.2实验样品特点发现毒理学的研究性质决定了其研究手段必须具有快速灵活、消耗样品量少、成本低、实验周期短、可同时检测大量样品等特点。目前,在发现毒理学研究中广泛采用的技术有:早期毒性筛选系统、毒性作用机制研究、计算机虚拟筛选和毒理组学技术等。2.2.1常用的毒性筛查方法体外短期毒性筛选是指以体外培养的低等生物或高等生物的组织、细胞、细胞器为模型,以各种生物学指标为检测终点的试验系统。随着物理、化学检测手段的进步,这些筛选模型正逐步走向微型化、自动化、高通量化,并引进了大量新的检测技术和方法。目前,早期毒性筛选系统所涵盖的毒性终点和相应的检测方法有:检测基本细胞毒性的MTT比色法、长期蛋白合成抑制试验等;检测遗传毒性的Ames波动试验、SOS显色试验、双核细胞微核试验等;体外检测睾丸毒性的大鼠种质细胞原代培养,支持细胞原代培养,原代种质细胞与支持细胞共培养,人永生化支持细胞株培养等及检测发育毒性的各种模型,可用于NCEs的发育毒性筛选和机制研究。应用早期毒性筛选系统进行药物毒性研究最突出的优点是:①能同时进行系列化合物的毒性比较。②具有快速短期、动态灵活、样品消耗量小、成本低等特点。③毒性筛选的结果通过定量结构活性分析可指导系列化合物的结构改造。其最终目的是找出系列NCEs中最适宜成为新药的化合物实体,其观察的实验终点与新药审批机构规定的临床前新药安全性评价实验终点基本一致,系统的有效性和可靠性已在国外的研究中获得证实。2.2.2建立和完善安全的危险性评估体系药物的毒性作用机制是指从机体接触药物开始至最终表现毒性损伤之间的一系列分子事件,这些事件构成一条首尾贯通的因果链,并按照一定的时空顺序发生。一般而言,毒理学家常通过分析以下基本问题来研究毒作用的分子机制:①毒物如何进入机体或细胞,在体内如何分布和代谢。②毒物如何与靶分子相互作用。③毒物如何在分子水平上发挥其毒性效应。④有机体如何应对毒物的攻击,毒物攻击的下游生物学后果又是如何。从药物发现和开发角度看,研究药物的毒性作用机制可提高和改进药物安全性评价的相关性:①确定人群中的高风险亚组。②改进对人体健康的风险评价。③指导和加速更安全新药的开发。④建立急性中毒的解毒方法和治疗措施。⑤建立可监测毒物暴露及慢性毒性发生的生物标志物。⑥定向选择性杀伤细胞或组织(如肿瘤治疗)。⑦建立更具针对性及特异性的毒性筛选模型。目前,药物毒性机制研究中所采用的技术包括:毒理组学技术(基因组学、蛋白质组学和代谢组学等)以及RT-PCR等分子毒理学技术。2.2.3基于毒化的药物毒性作用机制研究过去对药物毒性作用机制的研究主要采用传统的体内和体外实验方法(如血液生化和组织病理学检查),然而对处在研发早期阶段的新药而言,这些方法存在一些不足:①对一些药物,特别是特异质肝毒性药物所致的自身免疫病等目前尚无合适的评价模型。②动物实验结果的预测性、相关性有一定局限。整体动物实验以细胞学、生理学、形态学和代谢为终点,由于物种间的生理和代谢差异,整体动物实验并不能完全预测人体的毒性反应,同时相对潜在的用药人群而言,动物实验的样本量过少。上述2种原因导致药物临床前和临床评价结果之间关联性较差,即使是采用种属外推和大剂量外推也不能完全确定药物的毒性。③在新药研发早期,合成的化合物种类多、样品量少,整体动物实验评价过程耗时长、样品消耗量大,在时间和效益上很难满足创新药物的研发需要。为弥补传统毒理机制研究方法存在的局限性,从系统全局角度解释药物毒性的原因,特别是对经过先导化合物技术(PreclinicalLeadOptimizationTechnologies,PLOTs)系统筛选出的候选新药,利用“组学”技术进行毒理机制研究,从而形成“反向毒理学”(reversetoxicology)的药物毒性作用机制研究的新型模式。这种模式主要技术包括毒理基因组学、蛋白质组学和代谢组学。运用毒理基因芯片技术在新药研发早期对NCEs进行毒性预测相关的毒性作用机制研究,能在相当短的时间内提供比一般毒理试验更多的有价值的信息,同时毒性生物标志物可用于体外细胞培养检定,在新药研发早期评价化合物的潜在毒性,提高候选新药的选择能力。运用毒理基因芯片可将实验剂量降低至接近人类日常暴露水平,进一步提高种属间外推的准确性,有助于阐明化合物在药效和毒性方面的种属特异性反应。但是由于许多细胞的功能调节是发生在蛋白质的结构域上,且体内蛋白质的合成存在动态修饰和加工,通常不由单一基因决定,因此仅仅从mRNA表达水平上难以预测蛋白质的表达水平,此时采用蛋白质组学技术能够对细胞或组织状态提供更精确的分子描述。毒理蛋白质组学是采用高分辨率的蛋白质分离技术和高效率的蛋白质鉴定技术,全景式地研究化合物作用过程中蛋白质表达谱的改变和蛋白质-蛋白质相互作用的变化,通过与蛋白质数据库的比对,根据它们间的相关性预测化合物的潜在毒性,二维聚丙烯酰胺凝胶电泳是其主要研究手段。与传统的方法相结合,利用蛋白质组学技术可以在细胞水平上通过鉴定新蛋白或蛋白质谱的变化来解释一些毒理现象,能更准确地预测药物在人体中所发生的毒性,在实验室和临床试验中对人和动物进行药物安全性观察。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学后发展起来的一门新的“组学”技术,指通过分析生物的体液、组织中的内源性代谢产物谱的变化来研究整体的生物学状况和基因功能调节。在药物毒理学研究中,基因组学和蛋白质组学是研究药物毒性和中毒机制的有效手段,然而有些药物可能只在药理学水平上产生作用,不影响基因的调节和表达;或者某些毒理学效应可能与基因的改变和蛋白质的合成无关,此时单从基因组和蛋白质组的角度考虑并不能非常准确地预测药物的毒性。但是生物体由于中毒或代谢损害引起的细胞功能异常通常会反映在体液成分的变化上,这样通过检测体液中生物小分子的改变可以探求机体的毒理作用方式。可见代谢组学补充某些毒理基因组学和毒理蛋白质组学无法研究的毒性问题,提供毒性筛选、毒性靶器官、毒性标志物和毒性作用机制等大量资料和信息。Coen等结合代谢组学和转录组学