生物反应工程大实验实验指导

生物反应工程大实验实验指导生物工程专业用生物工程教研室编著2014年9月淀粉酶的酶学性质研究前言：酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。酶是具有催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体，是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。本实验主要研究淀粉酶的酶学性质。淀粉是植物体中贮存的养分，贮存在种子和块茎中，各类植物中的淀粉含量都较高。淀粉是葡萄糖的高聚体，在餐饮业又称芡粉，通式是(C6H10O5)n，水解到二糖阶段为麦芽糖，化学式是（C12H22O11），完全水解后得到葡萄糖，化学式是（C6H12O6）。淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。淀粉酶一般可作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷键的酶。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和，最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖，其中真菌α-淀粉酶水解淀粉的终产物主要以麦芽糖为主且不含大分子极限糊精，在烘焙业和麦芽糖制造业具有广泛的应用。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精（又称α-糊精）。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50%，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70%分解限度的（最终游离出葡萄糖）。本实验通过利用淀粉酶水解可溶性淀粉产生还原糖，还原糖可使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。通过此原理进行淀粉酶的酶学性质研究。通过研究淀粉酶的性质，可使我们更好的了解它，并充分利用于工业生产、食品加工、医疗等产业。实验一pH对酶活性的影响一、实验目的了解pH对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。二、实验原理pH对酶活性影响的机理：pH影响酶活性中心某些必须基团的解离,而这些基团往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或具有最大催化活性；pH影响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态,从而影响酶对他们的亲和力；pH还可以影响酶活性中心的空间构象,从而影响酶的活性。本实验以淀粉酶为材料来研究pH对酶活性的影响。三、主要实验材料、仪器和试剂1.实验材料α-淀粉酶2.实验仪器（1）721可见分光光度计；（2）磁力搅拌器；（3）恒温水浴锅；（4）烧杯：100mL、500mL；（5）标准试管；（6）三角瓶：100mL、250mL；（7）漏斗；（8）容量瓶；（9）电子天平（千分之一）；（10）移液管等。3.试剂（1）0.2M磷酸氢二钠溶液：称取35.61g含2个结晶水的磷酸氢二钠，用水定容至1L。（2）0.1M柠檬酸溶液：称取21.01g含一个结晶水的柠檬酸，用水定容至1L。（3）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：DNS试剂配制：50g3,5二硝基水杨酸溶于4000mL水中，不断搅拌，缓缓加入80g氢氧化钠，使之完全溶解，继续搅拌，将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入，并小心加热，溶液最高温度不超高45℃。冷却至室温后定容至5000mL，置棕色（4）葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。（5）2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。4．淀粉酶活力测定淀粉酶活性测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法：取酶液用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适度稀释，取0.lmL加入0.9ml预先在50℃水浴中准确保温10min的底物溶液(2mg/mL可溶性淀粉，pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制)中（每个样品同时做3支平行），50℃准确反应10min，加入2mlDNS沸水浴5min，用冷水快速冷却，在721分光光度计在波长540nm下测定OD值。同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.lmL，先加入DNS试剂2.0mL，再加入淀粉底物溶液0.9ml，其余步骤与样品测定相同。具体加样顺序见下表：对照样平行样酶液100μL100μLDNS2mL底物900μL900μL反应50℃10min50℃10minDNS2mL显色100℃5min100℃5min吸光值测定OD540OD540酶单位定义为:在50℃，pH6.0条件下每分钟从底物中释放1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活单位(U)。四、实验操作1．葡萄糖标准曲线制作（可使用实验一中的数据）取15mm×180mm试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水，每个做3个平行。管号葡萄糖标准液蒸馏水葡萄糖含量OD540/ml/ml/mg0100.210.800.4

2

0.40.60.8

3

0.60.41.2

40.80.21.6

5102操作方法：在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以光吸收值为横坐标，葡萄糖含量（mg）为纵坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程（y=ax+b）。2．不同pH缓冲溶液的配制取六只洁净的三角瓶，按表1编号和加试剂：表1磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制三角烧瓶号123456pH值3.04.05.06.07.08.00.2M磷酸二氢钠（ml）4.117.7110.3012.6316.4719.450.1M柠檬酸（ml）15.8912.299.707.373.530.553．不同pH底物溶液的的配制用2中的缓冲液分别配置相应pH的底物。4．pH对酶活性影响的测定用2中不同pH的缓冲液将酶液稀释适当的倍数（即在pH7.0条件下反应，540nm光吸收在1.2左右的稀释倍数）,并与3中相同pH的底物在37°C下进行酶促反应，反应过程参照淀粉酶活力测定部分。五、结果处理记录实验结果，计算，以pH为横坐标、酶促反应速度为纵坐标作图，绘制pH(3.0-8.0)条件下的pH-酶促反应速度反应曲线，进行合理分析。六、讨论1.pH与酶促反应速度曲线是什么形状的，为什么？2酶的最适pH值受哪些因素影响？注意事项：1．加入淀粉酶的量要准确2．保温时间要准确实验二温度对酶活性的影响一、实验目的了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。二、实验原理每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。三、主要实验材料、仪器和试剂1.实验材料α-淀粉酶2.实验仪器同实验一。3.试剂pH7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：量取16.47ml的0.2M磷酸氢二钠和3.53ml的0.1M柠檬酸混合摇匀即可。其他同实验一。4．淀粉酶活力测定同实验一。四、实验操作在最适pH条件下，使酶在不同温度(50°C-80°C)条件下进行酶促反应，通过测定酶活性来确定最适反应温度。即用pH7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释酶液到适当的稀释倍数（即在pH7.0条件下反应，540nm光吸收在1.2左右的稀释倍数），再加入pH7.0的淀粉底物，然后分别在50°C、60°C、70°C、80°C、90°C进行酶促反应，反应步骤参见实验一。五、结果处理记录实验结果，计算，以温度为横坐标、酶促反应速度为纵坐标，对温度与酶促反应速度作图，进行合理分析。六、讨论1.温度与酶促反应速度曲线是什么形状的，为什么？2．酶的最适温度受哪些因素影响？实验三底物浓度对酶活性的影响一、实验目的了解酶浓度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。二、实验原理在适宜的条件下，若酶浓度一定时，反应速度随底物浓度增加而增加，两者间成正比。但若反应底物浓度达到一定数值时，反应速度达到最大值，此后随底物浓度的增加，反应速率基本不变。本实验以淀粉酶为例。加入不同浓度的底物，并比较在同一适当时间后，以DNS法检验还原糖的含量从而确认其反应程度。三、主要实验材料、仪器和试剂同实验一。四、实验操作1．不同浓度底物的配制用pH7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2%的淀粉底物。2．酶促反应将酶液用pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释适当的倍数（即在pH7.0条件下反应，540nm光吸收在1.2左右的稀释倍数），将保温后的1中不同浓度的底物，快速加入到上述试管中，摇匀，立即放入50°C恒温水浴中，进行酶促反应。具体步骤见淀粉酶活力测定。五、结果处理记录实验结果，计算，以底物浓度为横坐标、反应速度为纵坐标，对底物浓度与反应速度作图，进行合理分析。六、讨论底物浓度与反应速度的曲线是否符合米氏动力学曲线，为什么？实验四淀粉酶Km和Vmax值的测定一、实验目的1．了解底物浓度对酶促反应速度的影响2．掌握米氏方程、Km、Vmax值的物理意义及双倒数作图求Km、Vm值的方法。二、实验原理1．米氏方程：Michaelis-Menten在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：QUOTE(1)式中：V表示酶促反应速度，Vmax表示酶促反应最大速度，[S]表示底物浓度，Km表示米氏常数。2．Km值的测定主要采用图解法，主要有四种：双曲线作图法、Lineweaver-Burk作图法双倒数作图法、Hofstee作图法和Hanas作图法。由于Lineweaver-Burk双倒数作图法简单方便得到了广泛的应用。本实验主要以Lineweaver-Burk双倒数作图法来测定淀粉酶的Km值。其作图原理如下（图1）：取（1）式的倒数，变换为Lineweaver-Burk方程式：QUOTE(2)以1/V对1/[S]作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为Km/Vmax，纵截距为1/