免疫项目实验室内质量控制

免疫定性试验的质量控制免疫定性试验方法及特点免疫定性项目质量控制指标免疫定性项目的室内质控定性实验：指只提供两种反应结果的检测方法（即阳性/阴性或者是/否）。

阳性结果只说明分析信号超过了分析阈值（检出限）或临界值。定性试验类型：方法等类型：

筛查试验：用于检测整个人群或部分人群中分析物存在情况的试验。

诊断试验：用于检测临床上已怀疑某种分析物存在情况的试验。

确证试验：用于验证筛查或者诊断试验结果的试验。定性试验定性免疫质量控制指标精密度：定性测定的精密度；用COI或S/CO比值报告结果的精密度。准确度：常以敏感性（包括临床敏感性）、特异性（包括临床特异性）、阳性符合率、阴性符合率表示。分析敏感性（检出下限）对转化血清盘的检测能力分析特异性（交叉反应）干扰因素敏感性特异性分析敏感性分析特异性临床敏感性临床特异性概念当分析物存在时，其检测结果呈阳性或超过正常值范围的比率。当分析物不存在时，其检测结果呈阴性或者在正常范围内的比率。可重复检测出待测物质的最低浓度水平。不同类型标本检测下限可能不同。一种检测方法仅对样本中的待测物质反应，而与其他物质不发生反应的能力。当特定疾病存在时，患者标本检测结果为阳性或超过正常值范围的比率。当特定疾病不存在时，患者标本检测结果为阴性或者在正常值范围内的比率。意义准确度准确度测定下限交叉反应准确度准确度准确度（accuracy）：分析物的测定结果与真实结果之间的接近程度。准确度的定义在定性测定，是指样本阳性或阴性测定结果与其真实结果的一致性程度。通常通过方法学比较来实现。定性测定的精密度以COI或S/CO比值表示结果的定性免疫测定的精密度精密度定性测定精密度评价定性检测试剂或系统精密度时，应采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料。采用C5~C95区间描述分析物浓度接近C50的样本重复检测结果的不精密度。精密度精密度C5：5%检测浓度，指检测浓度为C5时将产生5%的阳性结果，浓度小于C5时将持续得到阴性结果。C95：95%检测浓度，指检测浓度为C95时将产生95%的阳性结果，浓度大于C95时将持续得到阳性结果。C50：临界值浓度，多次重复测定此浓度样本将获得50%阳性结果和50%阴性结果。精密度C5~C95区间称为检测系统或试剂的“灰区”。如果待测物浓度接近C50，测定结果具有不确定性，同一份样本多次检测结果不可能保持一致分析物浓度处于C5~C95区间以外时，对同一样本的检测将得到相同结果，因而C5~C95区间越窄，检测方法的精密度越好。精密度精密度定性测定精密度质量要求定性免疫测定精密度分析质量指标为C5~C95区间浓度范围≤C50±20%精密度以COI或S/CO比值表示结果的定性免疫测定的精密度同生化定量试验精密度。批内精密度（重复性）批间精密度（中间精密度）定性测定精密度质量要求批内精密度要求：CV≤10%，且批内CV≤（1+10%）*CV1

注：CV1为试剂盒说明书规定的批内CV批间精密度要求：CV≤15%，且批间CV≤（1+20%）*CV2

注：CV2为试剂盒说明书规定的批间CV准确度以与临床诊断、金标准方法和经过验证确认血清样本盘的检测比较来评价以敏感性、特异性、阳性符合率、阴性符合率等表示准确度敏感性和特异性诊断标准：确认分析物是否存在的最好的方法。诊断标准只给出两种结果：分析物存在或不存在。诊断标准可以是单个检测方法，如确认试验，也可以是不同方法和技术的组合，包括随访、公认的诊断指南等。准确度检测结果诊断标准合计分析物阳性分析物阴性阳性真阳性数（TP）假阳性数（FP）TP+FP阴性假阴性数（FN）真阴性数（TN）FN+TN合计TP+FNFP+TNTP+FP+FN+TN敏感性：TP/（TP+FN）*100%（分析物阳性中，检测结果呈阳性的比率）特异性：TN/（TN+FP）*100%（分析物阴性中，检测结果呈阴性的比率）阳性预测值：TP/（TP+FP）*100%（检测结果阳性中，分析物阳性的比率）阴性预测值：TN/（TN+FN）*100%（检测结果阴性中，分析物阴性的比率）符合率：（TN+TP）/（TP+FP+TN+FN）*100%（两种方法结果一致的比率）定性测定准确度质量要求筛查试验：敏感性≥95%；诊断试验：敏感性≥95%且特异性≥95%；确证实验：特异性≥98%。分析敏感性即最低检出限、分析灵敏度。分析物浓度位于C5~C95之外时，对同一样本的重复检测将得到相同结果。因而C95代表某一试剂可以测出的最低浓度。评估分析敏感性可使用国家参考品、经国家参考品标化的参考品；或可以溯源或量化的样本分析敏感性的质量要求对用于诊断感染性疾病患者抗原抗体的定性免疫测定，在不影响测定特异性的情况下，最低检出限越低越好。对转化血清盘的检测能力大部分抗原、抗体没有国际标准物质，评估了解分析敏感性只能通过对较强阳性样本的系列稀释进行。但机体产生的抗体是多克隆的，含量不均一，系列稀释后不能反映抗体天然产生的状况。由分析物从无到有的过程中不同阶段样本所构成的血清盘。评估分析敏感性的最佳方法。不同试剂检测同一个阳转血清盘，越早检出者越好。分析特异性（交叉反应）感染性疾病的特异抗原或抗体：分析特异性评估质量指标是指无特定病原体感染和特定病原体外的其他病原体感染者样本检测时，不应出现阳性。自身抗体的分析特异性：试剂盒所用抗原与特定自身抗体以外的其他抗体（包括其他自身抗体）的交叉反应程度。干扰因素是体外诊断造成测量误差的主要原因。常见干扰物质来源：异常标本：溶血、脂血、黄疸。类风湿因子、嗜异性抗体药物、生化代谢物等常见治疗药物，如生物素治疗干扰电化学发光免疫试验。干扰因素对临床实验室应了解干扰因素：干扰因素为何种物质干扰因素对检测试剂造成怎样的影响（假阳性/假阴性）如何排除或降低干扰干扰因素的质量控制要求在常见的一定浓度范围内不出现干扰，如“类风湿因子＜2000U/mL不出现干扰结果”如针对药物治疗影响可注明血药浓度及采样时间，如“使用生物素5mg/d的剂量时，需要在至少用药8h后方能采样。”

一、实验室环境条件

温度：设备最佳工作条件下温度范围及温度波动范围要求；各种试剂

储存及使用的温度范围，标本检测前保存所需温度范围。

取其最窄区间，且符合温度波动要求

湿度：检测仪器，辅助设备，试剂盒保存，检测过程

电磁：对大型精密检测设备检验过程的干扰

电压：稳压，不间断

实验室用水：仪器用水，试剂配制，反应过程，管路冲洗维护室内质控开展前的准备工作二、仪器与设备

微量移液器：校准，年度检定

离心机：定期维护保养，性能（转速、噪声、计时或者温度准确性）验证

水浴箱/恒温干燥箱：日常维护，校准

洗板机：维护保养（冲洗针头）

生物安全柜：维护，定期检查（过滤效果）

冰箱/冷藏柜：维护保养，定期除霜，制冷效果监测

全自动酶免分析仪（加样系统，温浴系统，管路系统及检测系统）：日常维护保养，年度校准

室内质控开展前的准备工作三、试剂及校准品

合格产品：经国家主管部门批准上市销售（CFDA注册证）

批检合格证书

启用前经充分的性能指标评价合格

合适的存储条件：温度、湿度、避光（如有需要）、洁净

室内质控开展前的准备工作

四、人员培训

试验原理，操作流程，注意事项/试验干扰条件、结果审核

流程标准化

考核评价培训效果

严格执行SOP文件及复查等规章制度

室内质控开展前的准备工作五、标准操作规程（SOP文件）

指导性强：源于试剂盒说明书，行业标准，实验室经验总结

实用性强：写我所做，做我所写

可及性强：不是文件柜中的高大上，而是实验台旁的教科书，有简易流程图或者简易操作指导

室内质控开展前的准备工作以COI或者S/CO比值表示结果的定性免疫测定的室内质控方案半定量免疫测定的室内质控方案定性免疫测定的室内质控方案室内质控方案的确定免疫检测方法的不精密度：SD总=其中：SD1代表环境条件的标准差，SD2代表设备状态的标准差，SD3代表试剂准备的标准差，SD4代表实验操作过程的标准差，SD5代表质控品及校准品等状态的标准差，……在开展室内质量控制之前，应将可以控制的误差产生因素尽可能地加以控制，这不但是做好室内质控的前提，也是保证常规检验工作质量的先决条件。室内质控开展前的准备工作以COI或者S/CO比值表示结果的定性免疫测定的室内质控方案

1、质控物的选择：

质控物类型：人血清基质

由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在，动物源性的基质可能引起非特异或中和反应造成假失控。室内质控方案的确定1、质控物的选择：

一般选择生产者声明在一定保存条件下（2-8℃冷藏或-20℃冷冻）有效期6个月以上的质控物。要特别注意原装瓶有效期和开瓶有效期、分装瓶有效期，通常后二者的有效期要短许多。实验室应对开瓶有效期、分装瓶有效期进行验证，以指导质控物规格的合理选择和单次分装量的大小。

质控物订购数量应满足同批号至少半年的使用量，以避免频繁调整质控物均值。室内质控方案的确定1、质控物的选择：

至少包含弱阳性质控物和阴性质控物。

弱阳性质控物：浓度宜选择2～4倍Cutoff值左右。

阴性质控物：宜在0.5倍Cutoff值左右。

评价不同批次试剂的批间差异时，有建议选择一份S/CO值在1.5左右的极弱室内质控样本，以判断每批次试剂盒的检测下限（分析灵敏度）是否达到试剂盒说明书的声明。

高值或超高值阳性质控物是用来监控“HOOK效应”的，应该在引进分析方法或试剂盒时评价，不需要长期监控，同时其测定值远高于CUTOFF值对弱阳性结果的监控也无任何价值。室内质控方案的确定

1、质控物的选择——自制质控品

CNAS-GL052017《实验室内部研制质量控制样品的指南》

CNAS-GL032006《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》

大量临床免疫项目（ELISA）无商品化的质控物，实验室需自制。

1）收集阳性血清/血浆(无明显溶血、黄胆、脂血和细菌污染)，收集量至少满足本室使用6个月以上；

2）

血清/血浆需经56℃、10小时灭活传染性病原体后使用，或者选择经检测HBV、HCV、HIV、TP等传染性因子阴性的血清/血浆；

3）0.2μm生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；室内质控方案的确定1、质控物的选择——自制质控品

4稀释：用正常人阴性血清稀释,选择在2-4倍CutOff值附近的阳性值；

5赋值：与定值参考品进行对比、求值(非必需)。若未定值则视为非定值质控品，仅用于评价试验的重复性而非正确性；

6分装：根据每日用量分装至一小瓶，密封保存、贴标签，-20℃冻存备用；

7均一性及稳定性评价。室内质控方案的确定

2、质控频率的选择：

全自动酶免检测仪：每分析日一次质控，至少包含1份弱阳性质控和1份阴性质控；

半自动化检测设备或者手工操作：每分析批一次质控，至少包含1份弱阳性质控和1份阴性质控；

质控物位置应随机放置且覆盖检测孔位，尽量不要将质控物固定在某一个空位，这样不利于检出检测系统的随机误差。

室内质控方案的确定

3、质控物选择的误区：

试剂盒中自带的阴性对照和阳性对照代替阴性质控和阳性质控。绝对禁止！

试剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算CutOff值或阈值的，同时也可检验试剂盒各成分的有效性，以及判断操作（尤其是手工操作）的正确性，也有相应的有效性判断标准，但只能在同批号试剂内使用，不能作为质控指标。

质控必须是可监测到不同批号试剂间变化的“外对照”。室内质控方案的确定4、质控规则的选择：优先定性规则阴阳性符合，即阴性质控不能做成阳性结果，阳性质控品不能做出阴性结果。定量分析质控规则

Westgard多规则质控方法，Grubs质控判断规则，CutOff验证值计算法，直接概率计算法……室内质控方案的确定4、质控规则的选择：

Levey-Jennings质控图Westgard多规则质控方法

常用质控规则（6个）：12s,13s,22s,R4s,41s,10x

12s:告警规则：当质控测定值违反12s规则时，则启动其他规则进行判断，只有所采用其它规则判断质控测定值均在控时，方可说明该测定批在控；只要所采用其它质控规则之一判断该质控测定值失控，即认为该测定批失控。

13s,

R4s：反映系统误差

22s,41s,10x：反映随机误差

CNAS-CL39:2012临床免疫学定性检验领域的应用说明建议：至少利用一个偶然误差及一个系统误差规则。阴、阳性质控物的检测结果必须分别为阴性和阳性。室内质控方案的确定

室内质控方案的确定R4s41s质控数据12s否否13s22s10x否否否否否在控，接受分析批结果是是是是是失控4、质控规则的选择：

Westgard多规则质控方法的统计学意义：

12s:假阳性率发生的概率

为4.5%（200次质控数据

中有9次假失控发生）

13s:假阳性率发生的概率

为0.3%（1000次质控数

据中有3次是假失控）

室内质控方案的确定实例：某批号的ELISA乙肝表面抗原试剂的cutoff值为0.105，其验证值为0.067，阳性质控物均值为0.215，则

阳性失控上限为：0.215×[1+（0.105-0.067）/0.105]=

0.292；

阳性失控下限为：0.215×[1-（0.105-0.067）/0.105]=

0.137。

在Y轴上的三个点为：0.292（失控上限）、0.215（质控均值）、0.137（失控下限）。室内质控方案的确定5、“假阳性结果”出现概率的统计学计算方法

基于日常检验的阳性率

适用于长期观察判断检验结果的变化趋势，以期寻找引起检测系统变化的系统误差。（使用前提：研究人群稳定，未发生质的变化）室内质控方案的确定5、“假阳性结果”出现概率的统计学计算方法

直接概率计算法

统计学原理：小概率事件在一次试验中发生的机会非常小（一般设定发生概率a=0.05），基本上不可能发生。

在实验室质控活动中，失控的发生是“假失控”是小概率事件，如果一次试验中发生了“失控”事件，则认为失控是由假失控导致的不太可能成立，则认为失控发生是由某种因素（系统误差或者随机误差）引起的，借以发现引起实验室误差的各种因素并加以纠正，或采取预防性措施予以消除，由此提高实验室质量水平。室内质控方案的确定5、“假阳性结果”出现概率的统计学计算方法

直接概率计算法

对每天的日常病人结果中阳性率出现的概率进行计算，如果这种结果出现的概率≤5%时，则可判为失控。

在一个实验室中某检测项目结果的阳性率为p,计算在n个标本中有k个阳性结果的概率：

（1）根据泊松分布的概率计算（标本量大时）：

其中：n为当次实验标本数，k为阳性个数，p为阳性率室内质控方案的确定

5、“假阳性结果”出现概率的统计学计算方法

直接概率计算法

（2）根据二项式分布的概率计算（标本量小时）：

其中：n为当次实验标本数，k为阳性个数，p为阳性率

室内质控方案的确定

实例：一个实验室中某项目每次检测结果的阳性率约为2%，则在100个样本中出现8个阳性结果的概率为多少？

根据泊松分布，可使用公式进行计算其概率，将n=100,p=0.02,k=8代入公式计算可得：

P（x=10）=28e-2/8！=0.0009（0.09%）

P（x=10）＜0.05，即可认为存在假阳性。室内质控方案的确定室内质控方案的确定5、失控的判断及处理措施：

阴、阳性质控物的测定值均应在质控图中标出。

阳性质控值重点是测量下限，阴性质控值