自噬研究的相关知识

、自噬溶酶体系统2021/10/10

1什么是自噬?自噬

(autophagy)

性细胞死亡，是凋亡和坏死之外的第三种程序性细胞死亡方式.自噬是真核生物进化过程中高度保守一类

降解途径，通过形成双层膜的自噬体，将蛋

白质等生物大分子或细胞器(线粒体等)回

收至溶酶体将其降解为氨基酸、单糖等小分

子，实现循环再利用。自噬体的半衰期8

min左右，是细胞对于环

境变化的有效反应。2021/10/10

2细胞自噬的分类——根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同1

、巨型细胞自噬

(macroautophagy),

又称为大自噬，

是指细胞内新生的球状脂质双层包裹胞浆蛋白和细胞

器，并运送到溶酶体降解的自噬行为。2

、微型细胞自噬

(microautophagy),

又称为小自噬，

是指通过溶酶体膜的内陷、突起和/或分隔，直接吞

入细胞浆的自噬行为。3

、分子伴侣介导的细胞自噬(chaperone

mediatedautophagy,CMA),

是指由分子伴侣将靶蛋白转送至溶

酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。2021/10/10

3溶酶体异体吞噬内吞作用质膜2021/10/10

4蛋白酶体LAMP-2A胞质分子伴侣自

吞

复合体分子伴侣介导的细胞自噬泛素-蛋白酶体系统微型细胞自噬巨型细胞自噬前自噬体胞质蛋白自吞小泡细胞质泛素WControl

StarvationLC3ILC3Ⅱ500

nmAutophagy

is

a

cellular

degradation

system

in

which

cytoplasmiccomponents,

including

organelles,

long-life

protein

are

sequestered

by

double-membrane

structures

called

autophagosomes

a

nd

the

sequestered

materials

are

degraded

by

lysosomal

hydrolases2021/10/10

5Autophagy基础自噬和诱导自噬基础自噬：

是一种在大多数细胞中持续发生对较低的细胞自噬过程，对细胞内物质的更环境稳态的维持具有不可或缺的作用。诱导自噬：

是细胞应对外界刺激的一种保

少营养物质或能量、受到氧胁迫等情况下，

水平在短时间内剧烈升高的细胞自噬过程。如哺乳动物出生后初期，由于母体不再提供营养来源，幼体的细

胞自噬非常活跃，这为维持其生命活动起了非常重要的作用。2021/10/10

6自噬进程1、

自噬的诱导激活2、

自噬体的成核和延伸3、

自噬体与溶酶体融合4、

内容物降解Sequestration

Vesicle

formation

Fusion

DegradationPhagophore

Autophagosome

AutolysosomeLysosome第一步：

自噬的诱导一系列自噬相关基因

(autophagy-related

gene,Atg)

组成的复合体参与调控自噬体的形成。主要是Atg1/ULK1

复合体，包括Atg1

、Atg13

、Atg17,mTORC1

磷酸化Atg1/ULK1和Atg13抑制自噬的起始。mTORC1

失

活

=

>ULK1

去

磷

酸

化

-

>

自噬激活2021/10/10

8p150Vps34

Becn1AutophagosomeAutophagosome2000

GENES&

DEVELOPMENT2021/10/10

9mTORAMPKULK1/2

ATG13FIP200

ATG10LysosomeATG5

ATG②ATG16LINITIATION

ELONGATION

CLOSURE

MATURATION

DEGRADATIONcargoLC3-

1-Lysosomal

enzymesIsolation

Membrane(Preautophagosome/

Phagophore)inductionAutolysosomeIsolation

Membrane

JumpyMTMR3Atg14-Vps34-beclin1

complexAtg14-Vps34-beclin1

complexJumpyMTMR3OmegasomeULK1-Atg13-FIP200-Atg101

complexANTIOXIDANTS

&

REDOX

SIGNALINGVolume

14,

Number

11,2011Atg12-Atg5/

Atg16

complex1.Initiation2021/10/10Nucleus第二步：

自噬体的成核，

细胞在接受自噬诱导信号后，在胞浆中形成一个小的膜样结构：分离膜(isolation

membrane,IM),

然后不断向两边延伸，成扁平状，被称为前自噬体(pre-

autophagosome

PAS)

,

是自噬发生的标志之一。需要Atg6(Beclin1)-ClassⅢ

PI3K

复合体以及Atg12-Atg5-Atg16L

复合体.形态特点：

自噬前体多呈新月形或半环形，为游离双层膜结

构，两层膜之间有腔。随着自噬前体增大和包裹内容物，内

腔变得不明显。多种ATG

蛋白参与自噬前体的组装。组分来源：

来源于独立形成的特殊膜结构或线粒体、内质

网或高尔基复合体等膜结构。2021/10/10

11p150Vps34

Becn1AutophagosomeAutophagosome2000

GENES&

DEVELOPMENT2021/10/10

12mTORAMPKATG13)

ULK1/2XFIP200

ATG101LysosomeATG5ATG16LINITIATION

ELONGATION

CLOSURE

MATURATION

DEGRADATIONcagoLC3-Lysosomal

enzymesIsolation

Membrane(Preautophagosome/Phagophore)inductionAutolysosome34

|

2021/10/10

13DsRed

ER

GFP-FYVE-TM24

min

32

min30|8

min280

min第二步：

自噬体膜的延伸，

自噬前体在两个类泛素系统作用

下，包括Atg12-Atg5-Atg16L

复合体和LC3(Atg8)

作用下，LC3不断接受PE,

扩展膜的长度，成为成熟的闭合自噬泡。形态特点：

自噬前体由半月形，不断延伸成闭合的完整的双

层膜结构的圆形自噬泡，内容物为不断捕获的待降解的衰老

的蛋白、细胞器、蛋白聚集体。LysosomeATG5ATG12ATG16LAutophagosomeAutophagosomeINITIATION20CLOSURE

MATURATION

DEGRADATIONAutolysosomeELONGATION14E2E1Atg12Atg16Atg12Atg5Atg5Atg12LC3-ⅡAtg12Atg5Aj¹6PASAig16Aig5Atg12PELC3-I

LC3-I-GlyAtg32021/10/10

15Atg10Atg12图2-7

自噬小泡的延伸LC3-ⅡE2自噬的标记物第三步：

自噬体与溶酶体的融合，被运送到溶酶体，两者的

生物膜融合，变成一个自噬溶酶体(atuolysosome)。形态特点：

多呈圆形或椭圆形。由于自噬体内膜很快被降解，

在透射电镜下自噬溶酶体常不易与其他形式的溶酶体区别。2021/10/10

16LysosomeAutophagosomeLysosomal

hydrolase

AutolysosomeVESICLE

BREAKDOWN

&

DEGRADATIONVESICLENUCLEATIONVESICLEELONGATIONlsolationmembraneDOCKING

&

FUSION第四步：

自噬溶酶体内的酸性水解酶降解囊泡中的内容物，

成为降解性自噬体(degradative

autophagic

vacuole)。米lysosomal

hydrolasesAtcphagosome3.Maturation4.Autophagosome-Lysosome

fusion2.ElongationAutolysosomeLysosome5.Degradation202

Omegasome

The

amount

of

LC3-

11

17Isolation

Membrane(Preautophagosome/

Phagophore)nucleus1.Initiation①自噬的诱导②自噬体的成核

和延伸③

自噬溶酶体

的形成④内容物的降解质膜自陆外延体Class

I

Ptdins3K

复合物ULK1/2复合物mAtg9LC3-II2021/10/10○

通

透

醇

酸

性

水

解

酶QOOCOP

Atg12-Atg5-Atg16L复合物

自噬溶酶体自噬囊泡自噬小体核内体溶酶体181、mTOR

活性调节2、

胰岛素(激活mtor;

抑制FoxO3)自噬2021/10/10

19自噬的调节应激

缺氧Akt/PKB胰岛素生长因子受体营养

充足mTORC1RhebmTORRaptor饥饿AMPKClassⅢ

PI3KULK1

复合体RapamycinIRS雷帕霉素作用的靶位点(Taget

of

rapamycin,TOR)是氨

基酸、

ATP

和激素的感受器，它

在调节细胞生长和自噬的发生过

程有重要作用。TOR(target

of

rapamycin)能感受细胞的多种变化信号，加强

或降低自噬的发生水平。细胞内

ATP

水平、缺氧等细胞信号都可

直接或间接通过TOR

将其整合，从而改变细胞的自噬发生，应对不

同的外界环境刺激。2021/10/10自噬调控的中心分子TOR(target

of

rapamycin)生长因子受体激活剂活化ClassPI3KAkt

信

号

通路mTor注

：线粒体胞质蛋白生长因子

生长因子受体RapamycinD.

自

噬

体

破

坏3MAWortmanninA.

诱

导BAtg1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，

哺乳动物中同源蛋白ULK1,ULK1

以复合

物的形式存在，除了ULK1

本身，还包括mAtg13、FIP200

(一种与黏着斑激酶FAK

相互作用的蛋白)和Atg101。当营养足够时，哺乳动物雷帕霉

素靶蛋白复合物1(

mTORC1)

与

Atg1/ULK1

复合物与结合，通过磷酸

化Atg1/ULK1

和ATG13

从而抑制自

噬

的

起

始

从

而

抑

制

自

噬

。在饥饿的条件下，

mTORC1

从

Atg1/ULK1

复合物上分离，从而诱导

自噬体的成核(Nucleation)和延伸(Elongation)。2021/10/10Atg9L囊

泡

?Beclin

1Bcl2ULK1-Atg13-

FIP200-Atg101复合物ER

内质网Beclin1-Atg14-Ambra1-Vps15-Vps34

(PI3K)Atg1/ULK1

蛋白激酶复合体胰岛素生长因子

氨基酸mTORC1ULK1

-Atg13

-FIP200-Atg101Exo84-exocyst引发自噬complexRalBAMPK(AMP-activated

protein

kinase)AMPK

是细胞中感受能量状态调节代谢的一个蛋白激酶，在自噬

发生的调控中也发挥着重要的作用。低ATP水平状态下(如饥饿或

缺氧)AMPK

能感受AMP

的水平变化而激活，从而磷酸化结节性硬化

复合体TSC2(tuberous

sclerosis

protein)加

强TSC1/2

对Rheb

的MAPK

/Erk1/2Signalingp53

/Genotoxic

StressGSK3)AMPK)energy

stressPI3K-I/Akt

SignalingAMPK的活性被抑制，诱导细胞发生自噬。p150

ULKPI3KII

Atg13

FIP200AminoAcidsdulSignalin

gG

LTSC1/2RhebmTOR抑制，最终使mTORmTOR

RaptorPRAS40AutophagyAMP:

ATPAmino

acRapamycinBeclintAtg9/mAtg9Atg9是迄今发现的唯一一个编码跨膜蛋白的

At

g基因，

能通过影响膜泡运输对自噬发生起调控作用。

营养物质缺乏

时，

Atg9

与Atg23、Atg27结合，将它们运输

至PAS;Atg9L囊

泡Beclin

12021/10/10mTORC1ULK1-Atg13-

FIP2

-

tg

0le1xULK1-Atg13-FIP200-Atg101复

合

物ER

内

质

网胰

岛

素生

长

因

子

氨

基引

发

自

噬Exo84-exocystBeclin1-Atg14-酸RalBBcl2在Atg5-Atg12-Atg16

连接系统中，首先

由Atg7(E1)活化Atg12;

然后将Atg12传递给类Atg10(E2)

最后，

Atg12

被传递到Atg5,

与Atg5

的Lys共价结合形成Atg12-

Atg5复合物。自噬发生时，

Atg16

和Atg12-Atg5结合，

Atg16

含有一个螺旋卷曲结构

易于形成低聚物，使得其能把更多的

Atg12-Atg5连接起来形成巨大复合物。从

而可能为参与自噬泡形成的蛋白质提供相

互作用的平台。

自噬发生时，此复合物定

位于隔离膜上，参与

LC3-II的形成过程，从

面保讲自噬泡膜的延长。Atg5-Atg12-Atg16

复合物自噬发生过程中有两组类泛素化修饰过程，分别发生在Atg5-

Atg12-Atg16

连接系统和Atg8/LC3

连接系统中，用于隔离膜的延长和自噬泡的形成。自噬体Atq12Atg12-Atg7(E1样酶)Atg12-Atg10(E2样酶)Atg12-Atg5Atg12-Atg5-Atg16L1proLC3Atg4LC3LC3-Atg7(E1

样酶)

LC3-Atg3(E2

样酶)

LC3-PEDFCP1核粗粒体隔离膜Ato12-Atg5DFCP1需的。LC3

合成后，最初以pro-LC3

形式存在，然

后立刻被Atg4B

切割形成LC3-I。

自噬发生时

,

均匀分布于细胞质中的LC3-I

被

Atg7(E1)活化并与其形成硫酯键，然后被传递给Atg3

(E2)

,

并最终在Atg5-Atg12-Atg16

复合物

(E3)

的帮助下连接上一个PE

分子，形成具

有膜结合能力的LC3-II。Atg16L

的细胞定位决定了LC3

成熟的位置，并促进LC3-II结合到

自噬泡上。Atg8/LC3LC3:

是酵母Atg8

分子在哺乳动物中的同源物，是自噬

发生的一个标志蛋白。功能：促进自噬泡膜的延长和融合，是自噬泡形成所必Atg12Atg12-Atg7(EI样酶)Atg12₂Atg10(E2

样酶)Atg12-Atg5Atg12-Atg5-Atg16L1proLC3Atg4LC3LC3-Ata7(E1

样酶)

LC3-Atg3(E2

样酶)

LC3-PEDFCP1核粗粒体2021/10/10自噬体Atg12-Atg5隔离膜-Atg16LiATG6/Beclin-1自噬小泡的成核需要含有ATG6

(其哺乳动物同源蛋白命名

为Beclin

1)的复合物，这个复合物能够与第三类磷酸肌醇3激酶

VPS34

形成超级复合物并使其激活产生磷脂酰肌醇3磷酸。胰

岛

素生

长

因

子

氨

基

酸囊

泡Beclin1-Atg14-复

合

物2021/10/10ER

内

质

网Bc12PI3P

可以组装一些含有PX

和FYVE

结构域的蛋白质到

早期自噬泡产生的位置，促

使自噬前体的形成。ULK1

-

Atg13FIP2

0o-Amtg

0le1x引

发

自

噬-RalBExo84-exocystmTORC1Ata9L多种自噬相关蛋白结合，传递自噬信号促进自噬发生。1、

如与Atg14

结合形成Atg14-Vps34-

Vps15-Beclin1

复合物参与自噬泡的形成；2

、与VRAG结合形成VRAG-Vps34-Vps15-Beclin1

在自噬泡成熟和运输中起作

用。3

、

促进产生磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P),

PI3P可以组装一些含有PX

和FYVE

结构域

的蛋白质到早期自噬泡产生的位置，促使自

噬前体的形成。2021/10/10Vps34/PI3K-Beclin1复合物Vps34

是哺乳动物中的第III类PI3

K

。在Vps34

复合物中，

Vp

s34

因结合Vps15

而被激活，并进一步结合Beclin1

形成Vps34-Vps15-

Beclin1复合体。胰

岛

素功能：

自噬发生时，

Vps34-Vps15-Beclin

和

生长因子

氨基酸ULK1-Atg13-

FIP200-Atg101复合物ER

内质网Atg9L囊

泡

?Beclin

1FIP200-Atg101complexBeclin1-Atg14-

Ambra1-Vps15-Exo84-exocyst引

发

自

噬ULK1

-Atg13

-mTORC1RalBBcl2自噬体v

mTORC1:

哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白复合物1v

Atg12/LC3:

两种泛素样加工系统，包裹自噬底物

形成自噬体。v

Atg12-Atg5-Atg16L1:与外膜结合，促进伸展v

Atg5:

决定膜伸展方向v

LC3-

Ⅱ:

自噬体标志分子,判断诱导或抑制Atg12Atg12-Atg7(E1样酶)Atg12-Atg10(E2样酶)Atg12-Atg5Atg12-Atg5-Atg16L1Atg12-Atg5-Atg16Li复合物proLC3Atg4LC3LC3-Atg7(E1样酶)LC3-Atg3(E2

样酶)LC3-PELC3-PE

隔离膜DFCP1

OFCP1核粗粒体v

Atg9:

嵌膜蛋白来回循环

移动活化该激酶复合物从

而产生自噬分隔膜。v

PE:磷脂酰乙醇胺28dlCd胰岛素生长因子

氨基酸mTORC1自噬的分子机制ULK1-Atg13-

FIP200-Atg101复

合

物Beclin1-Atg14-Atg9L

囊泡?Beclin

1Bcl2A

a1-

pi3s

-)5K1V复psmbrULK1-Atg13-FIP200-Atg101引发自噬Exo84-exocystcomplexER

内质网RalBSequestrationLC3-HAtg3

PEAtg7LC3-1P13K-I/AktSignalingAMPKAminoAcidsGβLSignalingPhagophoreAtg16Atg12Atg16Atg5MAPK

/Erk1/2Signalingp53/GenotoxicStressAutophagosomeLysosomeHBeclin1Atg14MembraneNucleationBcl-2Apoptosis

RubiconULKII

Atg13

FIP200mTOR

RaptorPRAS40dlp150PI3KAutophagolysosomeAtg10Atg7AMP:

个

ATPLysosomeFusionAtg4Atg5LC3g12NeurodegenerativeDiseasesType

ⅡDiabetesFatty

LiverInfectiousDiseasesAggregate-prone

proteinsAutophagyPhysiological

and

pathological

roles

of

autophagyInnateImmuneSystemCardiomyopathy2021/10/10ProteasomeCell

DeathdeathCancerAging30自噬的生物学意义1、

应激功能细胞自噬是细胞在饥饿条件下的一种存活机制。在营养充足条件下，自噬发生处于较低水平，仅在胞质中去除受损和多余的细胞器以维持细胞内环境稳定，称为

基本自噬。细胞营养缺失时，细胞立即启动自噬以维持胞质

中氨基酸池的平衡，可通过合成新的蛋白质、能量生成和促

进糖异生来避免细胞“饿死”。2021/10/10

312、

防御功能在细胞受到致病微生物感染时，细胞自噬起

一定的防御作用。某些细菌和病毒可逃离异噬途径，避免溶酶体

消化。李斯特菌属、志贺杆菌属、立克次体属等的

细菌可通过降解异噬体膜逃入细胞质。细胞能够通

过自噬发挥先天性免疫作用，抵抗细菌入侵。结核

杆菌通常定居于异噬体内，但可激活自噬途径被溶

酶体酶杀死。自噬也可以将病毒核酸转运至胞内感受器上激活

天然免疫，还可以将病毒抗原递呈给

MHC

类分子激活适应性免疫，发挥抗病毒作用。2021/10/10

323、

维持细胞稳态在骨骼机和心肌，细胞自噬有特殊的“看家”(house

keeping)

功能，帮助细胞浆成分，包括线粒体，进行更新。4、延长寿命细胞自噬可降解损伤的细胞器、细胞膜和变性蛋白等胞内成

分。如果细胞自噬受损衰竭，细胞损伤就会堆积、累加，产生老

化。长期减少热量摄入，在一些物种能延长寿命。2021/10/10

335、

参与控制细胞死亡及癌症自噬样细胞死亡

(autophagic

cell

death,ACD):在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前

胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞

缺乏凋亡的典型特点，如核固缩

(pyknosis),

核破裂、

细胞皱缩、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样细胞

死亡，

它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，

被命名为Type

II

cell

death,

相应的，凋亡为Type

Icelldeath,

坏死为Type

III

cell

death。尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因

目前还存在很大的争议。到底是自噬引起死亡还是死亡

时有自噬发生，但不是直接原因?2021/10/10

34细胞自噬与肿瘤自噬在肿瘤发生中的双重作用，在多种人类肿瘤中

均存在自噬活性的改变。一方面，自噬可抑制肿瘤的发生：首先，

自噬可清除受损细胞器以避免有害的氧自由

基蓄积及突变的发生。其次，自噬可限制DNA

损伤，维持基因组完整性。

在永生化鼠肾上皮细胞中自噬活性降低可导致细胞DNA损伤，基因扩增，染色体非整倍性，从而增加了致癌性

突变率，促进了肿瘤的发生。再次，自噬可抑制细胞生长，诱发凋亡性细胞死亡。2021/10/10

35另一方面，

自噬通过限制细胞坏死和炎症促使肿瘤细胞存活于代谢性应激的环境中，这些肿瘤细胞所具有的高自噬活性能增强肿瘤对应激的适应性，

对肿瘤细胞在恶劣环境中的生存起到了一定的保护作用。当快

速生长的肿瘤细胞缺乏营养时，实体肿瘤内部血供不

良，癌细胞利用自噬机制对抗营养缺乏和缺氧，通过

降解胞内蛋白质及细胞器为肿瘤细胞的生长提供营养

及能量，可能利于肿瘤细胞在低血管化的环境中生长。2021/10/10

36自噬检测技术1自噬性结构的电镜下形态学观察---电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构电镜下可观察到双层膜的自噬体和单层膜的自噬溶酶体结构，其中包裹着未被完全降解的胞浆成分。ERAViAVi400

nmAVdAvd400

nm缺点：电镜观察仅能证明

自噬性结构的存在，

难以

反映自噬活性的强弱。初始自噬囊泡(Avi)降解自噬囊泡(AVd)2021/10/10400

nm500通过免疫荧光的方法检测内源性LC3

或转染GFP-LC3

融合蛋白的表达，自噬诱导后的细胞表现为点状聚集增.理论上，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量，根据点状聚集的密集程度可以判断细胞自噬的情况。可以火总体上大致反映自噬的增加或减少2

基于自噬体标记蛋白LC3

的检测方法微管相关蛋白1轻链3(LC3),LC3-

Ⅱ

始终稳定地保留在

自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记，2.1

通过构建绿色荧光蛋白(GFP)

和LC3

的融合蛋白，通过荧

光显微镜就可观察LC3在细胞中的定位。382.2LC3-

Ⅱ

的水平在某种程度上反映了自噬体的多少除了荧光显微镜观察LC3

外，LC3

还是生化方法检测自噬

体的有利工具。内源性LC3-II的量在某种程度上可反映细胞自

噬活性。因此，通过免疫印记方法检测LC3-

ⅡI信号的强弱来对

哺乳动物细胞自噬活性进行定量检测。2021/10/10

39Control

StarvationLC3ILC3ⅡX-

iSNutrientMock

X

Know

downStarvationp62LC3X-actinX

depletion

promotes

autophagyLC32021/10/10controlβ401

2

3

4

5

6GFPInternal

Control

→ZUZT/T0/70

412.3

GFP-LC3剪切分析GFP-LC3

切割LC3

连同自噬体内膜和内容物一起被溶酶

体降解，但GFP

在溶酶体中仅表现荧光信号猝灭，

GFP

本身

并不被降解，在自噬性溶酶体降解后会释放出游离的GFP.

有鉴于此，通过免疫印迹的方法检测游离GFP

蛋

白的

出现即意味着自噬性降解的发生。ProteinX—→3

基于自噬性降解的检测

“自噬潮”分析自噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。优点：

较单纯自噬体检测更能反映自噬活性，

“自噬潮”分析是反映自噬活性的可靠指标。3.1长寿命蛋白降解根据自噬机制主要负责降解长寿命蛋白的特性，先让细胞在

含有同位素标记氨基酸的培养基中生长一段时间(数小时至数天),细胞在此期间合成的蛋白质都将被同位素标记，然后换成

不含同位素的培养基，让一些被标记的短寿命蛋白通过蛋白酶体途径降解.在自噬诱导后，通过检测培养上清中释放的自噬性降解产

物的放射性活度即可反映细胞自噬性降解的能力。2021/10/10

423.2

RFP-GFP-LC3

的溶酶体呈递自噬诱导后，融合表达GFP-LC3

蛋白锚定于自噬体膜上并与自噬体一起与溶酶体融合，溶酶体内的酸性环境可以导致GFP

荧光信号的猝灭，红色荧光蛋白RFP

对酸性环境具有很好的耐受

性.借助于两种荧光蛋白的这种差异，通过构建RFP-GFP-LC3串联体，