酶工程：酶的分离

第四章酶的提取与分离纯化预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。初步纯化（roughfractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化（finefractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。

第一节酶的分离一、发酵液预处理(一)发酵液的相对纯化1.无机离子的去除2.杂蛋白质的去除3.色素及其他物质的去除(二）发酵液的固液分离1.影响发酵液过滤的因素

1）菌种2）培养基组成2.提高过滤性能的方法

1）絮凝和凝聚

2）稀释、加热

3）加助滤剂，常用硅藻土等。

主要方法是离心分离和过滤二、细胞破碎

（一）细胞壁组成

细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)

酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌:多糖（几丁质和葡聚糖）

微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌放线菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~300100~250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1%〜2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)几丁质(1%~2%)蛋白质(6%~8%)脂类(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂类蛋白质各种微生物细胞壁的结构与组成

细菌细胞壁的结构

酵母菌细胞壁的结构

M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖

（二）细胞破碎的方法

机械法物理法化学法生物法（酶解）

1.机械法：

1）液体剪切：搅拌、匀浆。

2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。2.物理法：

1）超声波破碎法。

2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中。

3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。3.化学法

应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。

1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。

2）表面活性剂处理：常用非离子型表面活性剂，如TritonX-100，Tween等。4.酶解法（enzymaticlysis）：

外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。

自溶法（autolysis）:

细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。（三）细胞破碎确认

1.直接测定破碎前后的细胞数：

破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。

2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。

3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。

三、酶的提取(extraction)

把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。

提取目标：

a.将目的酶最大限度地溶解出来。

b.保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。提取原则a.相似相溶。b.远离等电点的pH值，溶解度增加。

提取方法：（一）盐溶液提取

常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大。

（二）酸、碱溶液提取（三）有机溶剂提取四、离心分离（一）基本原理1.离心力

Fc=mac

＝mr

ω2

＝mr

（2

N/60）2

N为离心机每分钟转数（r/min）；

Fc通常以相对离心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字

g）表示。RCF=mr

（2

N/60）2/mg=1.12

10-5N2r

旋转半径用r平均代替r平均=1/2（r大+r小）cm

相对离心力与转速的关系

通常：低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表示，如：65000g。两者可换算或查测算图。计算近似RCF的列线图2.沉降系数:（sedimentationconstant）

指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentationvelocity）,用S表示。由于许多生物大分子的S值很小，所以定义10

13s

为一个沉降单位，1S=1

10

13s。

常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在1~200之间。

（二）离心机的种类按离心机转速的不同，分为：常速（低速）高速超速

名称

转速(r/min)

注意事项

低速离心机

6000

常温，注意样品热变性和离心管平衡

高速离心机

6000〜25000冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡

超速离心机

>25000冷冻＋真空系统（减少空气阻力和摩擦），离心管的精确平衡

离心机的种类

实验室离心机温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。使用超速离心机时先抽真空。离心的形式角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式由低速到超速均有。角式离心机和离心头（转子）角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。离心机的大小：落地式及台式小台式离心机离心管材质：玻璃，塑料强度：和离心速度相配大小：和转子配套高速超速管要加盖离心机操作平衡、定温、定速、定时。（三）常用离心方法

差速离心法沉降速度法密度梯度离心沉降平衡法等密度梯度离心1．差速离心

（differentialcentrifugation）

采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。

优点：操作简单。缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。

2）壁效应严重。

3）沉降的颗粒受到挤压。

差速离心分离示意图

（a）离心前的悬浮液（b）～（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况

2．密度梯度离心

（densitygradientcentrifugation）

样品在密度梯度介质中进行离心，使密度接近的组分得以分离的一种区带分离方法。

常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。特点：区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。

密度梯度离心示意图

（a）离心前（b）离心后

Densitygradientultracentrifugation密度梯度离心

步骤：A.形成密度梯度B.加样C.离心D.收集样品3.等密度梯度离心

又称沉降平衡离心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。特点：

介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。

等密度梯度离心示意图

（a）离心前；（b）离心后

密度梯度离心等密度梯度离心梯度介质常用蔗糖最大的梯度密度<最小密度的沉降样品常用CsCl最大的梯度密度>密度最大的沉降样品离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度分离依据密度相近，但沉降系数不同沉降系数相近，但密度不同沉降速度离心和沉降平衡离心的特点总结：等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。（四）应用根据不同离心目的，分为制备性离心：分离纯化和制备分析性离心：

测分子量、沉降系数、密度、纯度五、沉淀分离（根据溶解度的不同）使溶液中的溶质由液相转变为固相析出古老、实用、简单的初步分离方法在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：

⑴中性盐沉淀（盐析法）

⑵有机溶剂沉淀

⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）

⑷等电点沉淀

⑸有机聚合物沉淀（一）盐析沉淀法（改变离子强度）1.基本原理（盐溶和盐析）

向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：

1)盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。

2)盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。蛋白质的盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度盐析盐溶

原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域

1）中性盐的选择常用（NH4）2SO4，其突出优点：

a.溶解度大

b.分离效果好

c.不易引起变性

d.价格便宜2.盐析用盐2)盐浓度的表示用饱和（溶解）度表示:

溶液中饱和硫酸铵的体积饱和度＝溶液的总体积3)调整盐浓度的方式

a.饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：

S2-S1V=V0————1-S2式中V,V0——分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积S2,S1——分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度b.添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据

B(S2-S1)W=——————1-AS2A,B——常数，与温度有关。实际使用时，可直接查表（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。调整硫酸铵溶液饱和度计算表盐析操作低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40％。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration）、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。3.盐析曲线的制作

如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。蛋白质量(mg)或酶活力

102030405060708090100硫铵饱和度％

硫酸铵浓度（%）枯草杆菌

-淀粉酶发酵液的盐析曲线

4.盐析的影响因素1)离子强度和种类（介绍盐析常数）蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。

Ks代表盐析效率，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。

当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用β表示，盐析方程式可改写为：

logS=β-KsI

两种盐析法：Ks分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。β分级盐析法：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。2)蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。3)pH值：等电点处最易沉淀。4)温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）1.沉淀机理

降低溶液的介电常数部分地引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂丙酮

乙醇

甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。

3.优缺点：

优点：1）分辨率比盐析法高

2）沉淀不需脱盐

3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：容易引起蛋白质变性失活。

4.影响有机溶剂沉淀的因素（1）温度：低温（0℃）操作。（2）pH值：尽可能靠近其等电点。（3）离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液（4）蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/ml（三）等电点沉淀(isoelectricprecipitation)

1.原理:蛋白质在等电点时溶解度最低不同的蛋白质具有不同的等电点

2.使用方法单独使用较少（用于除杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法）。因为：蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。

（四）有机聚合物沉淀法

1.作用机理：与有机溶剂类似。2.沉淀剂：多用分子量为6000～20000的聚乙二醇（Polyethyeneglycol，简写PEG

）。3.优点：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。

（五）选择性变性沉淀法选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。

⑴热变性几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。

⑵pH变性等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。

⑶有机溶剂变性使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。六、萃取（extraction）分离

利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。特点：1）比化学沉淀法分离程度高2）比离子交换法选择性好、传质快3）比蒸馏法能耗低

（一）溶剂萃取法明确几个概念：料液：供提取的溶液。

溶质：料液中欲提取的物质。萃取剂：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂。萃取液：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液。萃余液：被萃取出溶质后的料液。反萃取（backextraction）：完成萃取操作后，将产物从有机相转入水相的萃取操作。

普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离，

因为:1）蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂2）蛋白质在有机相中易变性失活故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。

萃取操作的3个步骤：

1）混合

2）分离

3）溶剂回收单级萃取使用一个混合器和一个分离器

单级萃取流程93（二）双水相萃取技术

又称水溶液两相分配技术（partionoftwoaqueousphasesystem）

用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。

优点：1）每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；2）PEG、Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。

双水相的形成：

两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。

a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图

几种典型的双水相系统聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羟丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐甲基纤维素聚乙二醇（PEG）

磷酸钾、硫酸铵硫酸钠、硫酸镁2.萃取原理：

利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。3.应用

胞内酶的提取和精制:

除去细胞碎片，并使酶得到纯化。

几种典型的双水相萃取酶蛋白实例酶菌种相系统延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/盐天冬氨酸酶E.coliPEG/盐

-半乳糖苷酶E.coliPEG/盐亮氨酸脱氢酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脱氢酶Baker’syeastPEG/盐青霉素酰化酶E.coliPEG/盐

双水相萃取法的重要研究方向

——亲和萃取（亲和分配）

使用具有生物特异性的配基（ligand）来提高分离选择性。

亲和萃取酶实例

蛋白质配基胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂磷酸果糖激酶三嗪染料甲酸脱氢酶三嗪染料葡糖-6-磷酸脱氢酶三嗪染料（三）超临界流体萃取

兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。

超临界流体(supercriticalfluid，SCF）：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。

临界点的概念可用临界温度和临界压力解释：临界温度：高于此温度时，无论加压多大也不能使气体液化。临界压力：在临界温度下，液化气体所需要的压力。

SCF性质介于液体和气体之间：1)SCF密度接近于液体，溶解度高。2)SCF粘度和扩散系数接近于气体，传质扩散快。基本过程：1）在SCF中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。2）降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。常用超临界液态CO2作为萃取剂，

因为：1）液体CO2无毒2