蛋白乙酰化修饰在黑树莓花青素调节结直肠癌发生发展中的作用研究

蛋白乙酰化修饰在黑树莓花青素调节结直肠癌发生发展中的作用研究结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)是常见的恶性疾病,在中国结直肠癌的发病率逐年上升。表观遗传学的改变在结直肠癌的早期发生及进一步发展的过程中扮演重要角色。蛋白的乙酰化修饰是最重要的表观遗传调控之一,其主要是发生在赖氨酸上。赖氨酸残基的乙酰化修饰是可逆的,这个过程可以中和氨基酸的正电荷,并以不同的方式调节蛋白质活性。体内乙酰化动力学之间的平衡由组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylase,HDACs)和组蛋白乙酰化酶(Histoneacetylase,HATs)共同调节。HDACs的异常表达将会引起组蛋白以及非组蛋白的乙酰化修饰异常。乙酰化修饰的异常参与调节机体细胞内多种生物学事件,且与结直肠癌的发生和发展密切相关。黑树莓(Blackraspberry,BRB)果实中含有丰富的多酚类化合物,以花青素为主。在实验室先前的研究中,发现黑树莓花青素(BRBanthocyanin)作用于炎性结肠癌小鼠模型,通过调控组蛋白去乙酰化酶SIRT1发挥着抑制炎症的作用。本研究应用氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)诱导结直肠癌小鼠模型以及人结直肠癌细胞系,从体内及体外两方面共同探究蛋白的乙酰化修饰在黑树莓花青素对结直肠癌发生、发展中的作用及意义。结果表明:1.体内实验:AOM诱导的结直肠癌小鼠肠道上皮细胞中的乙酰化相关蛋白及其调控的下游分子在黑树莓花青素处理前后的变化情况。(1)WesternBlot检测黑树莓花青素调控乙酰化相关蛋白的表达。结果显示在小鼠肠上皮细胞中,黑树莓花青素可以上调蛋白的整体乙酰化修饰水平。下调SIRT1蛋白的表达,上调EP300、MOF蛋白的表达,影响体内的乙酰化水平。黑树莓花青素处理后,H4组蛋白K5、K12、K16赖氨酸位点的乙酰化水平也有明显的上调趋势。(2)WesternBlot检测非组蛋白ac-p65及其相关的下游信号分子蛋白水平变化。结果发现黑树莓花青素处理后,ac-p65表达显著上调,凋亡蛋白Bax上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达的下调,cyclin-D1与c-myc蛋白的表达下调。(3)免疫荧光检测结果表明:黑树莓花青素能够减少ROS的释放量;同时黑树莓花青素可抑制NOX2、NLRP3蛋白的表达,从而进一步抑制NLRP3炎性小体的激活。2.体外实验:选取结直肠癌细胞系SW480和Caco-2,分别给予不同浓度的黑树莓花青素(0μg/mL、25μg/mL及50μg/mL)处理细胞24h。(1)WesternBlot检测黑树莓花青素可以上调结直肠癌细胞SW480和Caco-2中蛋白的整体乙酰化水平。黑树莓花青素下调SIRT1蛋白的表达,上调EP300、MOF的蛋白水平,同时H4组蛋白的K5、K12、K16赖氨酸位点的乙酰化水平发生了上调。该部分研究发现与体内动物研究发现一致。(2)黑树莓花青素处理后,非组蛋白ac-p65的蛋白表达上调,凋亡蛋白Bax上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,cyclin-D1与c-myc蛋白的表达下调。利用免疫荧光检测经黑树莓花青素处理后p-p65的核定位情况,结果显示黑树莓花青素处理后,p-p65在SW480细胞中其核定位增加。(3)WesternBlot检测发现:黑树莓花青素抑制了NOX2、NLRP3蛋白的表达,NLRP3炎性小体的激活也同样受到抑制。综上所述,黑树莓花青素上调了蛋白的整体乙酰化水平,下调SIRT1蛋白表达水平,同时上调MOF、EP300这些乙酰化修饰的关键酶的蛋白水平,H4组蛋白K5、K12、K