犬源复合益生菌对脾气虚犬盲肠菌群的影响

犬源复合益生菌对脾气虚犬盲肠菌群的影响曹护群;贺濛初;舒迎霜;夏晓东;冯士彬;李玉;王希春;吴金节期刊名称】《《动物营养学报》》年(卷),期】2019(031)008【总页数】11页(P3810-3820)关键词】脾气虚犬;犬源复合益生菌;盲肠菌群;多样性;高通量测序作者】曹护群;贺濛初;舒迎霜;夏晓东;冯士彬;李玉;王希春;吴金节作者单位】安徽农业大学动物科技学院合肥230036正文语种】中文中图分类】S829.2肠道菌群是存在肠道内微环境中与机体互利共生的微生物。正常的肠道菌群能协助机体吸收营养、调节代谢、维护胃肠道内环境相对稳定［1］，肠道微生态的平衡亦是脾脏发挥生理作用的重要因素［2］。然而，当机体患脾气虚证时则会导致肠道内菌群失调。近年研究已证实肠道菌群与脾气虚证的发生发展紧密相关［3-4］，脾气虚时机体胃肠功能异常，脏器间平衡遭到破坏，进而导致肠道微生态平衡被打破，而肠道菌群的失调又影响机体对营养物质的吸收，降低机体的免疫力，加重脾气虚症状［5］。基于肠道菌群对脾气虚证的重要作用，临床上常采用益生菌等微生态制剂治疗脾气虚证。益生菌制剂可促进机体对营养物质的消化吸收、增强免疫功能，具有替代抗生素的临床治疗潜质［6］。临床研究发现，复合益生菌具有生物拮抗作用，可有效修复并优化肠道防御屏障，提高营养物质利用率［7］。相关研究证实，益生菌亦可以提高人类健康肠道中菌群的多样性［8］。罗云坚等［9］认为脾气虚证与腹泻型肠易激综合征(IBS-D)患者之间存在相似性，两者有共同的基因表达谱改变。Hod等［10］用复合益生菌治疗IBS-D患者8周后，可改善其肠道有益菌群定植。基于同源益生菌适用性更优原则［11-13］，本试验从犬粪便中获得芽孢杆菌和乳杆菌，经检测后制成犬源复合益生菌，探讨其对脾气虚犬盲肠菌群多样性的影响及调节作用，为犬源益生菌的临床应用提供试验依据。1材料与方法试验材料犬源复合益生菌犬源复合益生菌的制备：采集健康比格犬新鲜粪便，通过分离筛选培养后进行16SrRNA鉴定，得到鲁氏芽抱杆菌PP9、蜡样芽抱杆菌VP11、鼠李糖乳杆菌SWP05及嗜酸乳杆菌DMBCT6菌株，通过耐酸耐胆盐、生化试验及药敏试验［14-15］等检验合格后制备犬源复合益生菌，其中芽抱杆菌活菌数为6x107CFU/g，乳杆菌活菌数为1x108CFU/g。番泻叶番泻叶水煎液的制备：参照文献［16］，准确称取5kg干燥番泻叶(购自合肥立方大药房)，筛选去除杂质，清洗后装入纱布袋连同清洗上清液投入TD-100小型浓缩机组提取罐中，加10L蒸馏水，65°C提取1h，重复以上步骤3次，合并滤液，65C浓缩成5L的水煎液，冷却后4C保存。试验动物分组与脾气虚模型建立试验用比格犬由安徽农业大学动物医院提供。选取24只1岁左右的比格犬，体重(10.75±0.25)kg,适应性饲养观察7d，完成常规免疫与驱虫，确定为健康犬后方用于试验。将24只比格犬随机分为4组，分别为对照组、脾气虚组、自然恢复组和益生菌治疗组每组6只。饲养试验在安徽农业大学动物医院动物房进行，每组的6只犬安排在相邻2个犬舍，犬舍面积12m2左右，共占用8个犬舍。消毒、卫生防疫和日常管理按照正规宠物医院标准方法进行。试验开始后，对照组犬饲喂基础饲粮（基础饲粮组成及营养水平见表1）；脾气虚组自然恢复组和益生菌治疗组犬在饲喂基础饲粮的同时每天按照10mL/kgBW的剂量灌喂番泻叶水煎液，持续灌喂7d，制造脾气虚模型。在灌喂番泻叶水煎液7d后，造模犬均表现出大便溏泄、食少纳呆、消瘦、体重减轻、神态萎靡和毛色无光泽等症状，可判定试验犬出现中医脾气虚证候，造模成功。在试验第7天，随机选择4只脾气虚组试验犬安乐死后进行剖检。造模结束后，对照组、自然恢复组继续饲喂基础饲粮7d，益生菌治疗组在饲喂基础饲粮的基础上每天按照1x109CFU/只的剂量灌服犬源复合益生菌7d。试验期间观察各组犬的体征变化。分别于试验第0（分组后，给药前）、7和14天称量犬的体重，同时使用含乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）抗凝剂的采血管从犬前腔静脉采血1mL用于部分血常规指标检测。在试验第14天后，从对照组、自然恢复组和益生菌治疗组各随机取4只试验犬安乐死后进行剖检。表1基础饲粮组成及营养水平（饲喂基础）Table1Compositionandnutrientlevelsofthebasaldiet（as-fedbasis）%项目Items含量Content原料Ingredients鸡肉粉Chickenmeal20.00牛肉粉Beefmeal10.00鱼粉Fishmeal5.00鸡蛋粉Eggpower8.00羊奶粉Ewesmilkpower2.00脱水蔬菜Dehydratedvegetable5.00燕麦0atmeal10.00糙米Brownrice27.00海藻粉Seaweedmeal1.00果寡糖FOS1.00深海鱼油Deepseafishoil1.20油脂Grease4.00磷酸氢钙CaHPO41.80预混料Premix4.00合计Total100.00营养水平Nutrientlevels2）粗蛋白质CP24.00粗脂肪EE13.00粗纤维CF5.00粗灰分AshlO.OO水分MoisturelO.OO水溶性氯化物（以Cl-计）Water-solublechloride（asCl-）0.45赖氨酸Lys0.77钙Ca1.00总磷TP0.801） 预混料为每千克饲粮提供PremixprovidedthefollowingperkgofthedietFe358mg，Zn149mg，VA23400IU，VD54.4IU，VB110.25mg，VB210.25mg，VB616.8mg，烟酸niacin61.4mg，泛酸pantothenicacid42800pg,叶酸folicacid1640pg,生物素biotin335pg,VB122280pg。2） 测定值Measuredvalues。1.3粪便采集与16SrRNA测序试验犬处死后，迅速取出盲肠内容物于2mL灭菌冻存管中，放入液氮速冻，随后于-80°C冰箱中保存，用于高通量测序。从每个冻存管样品中分别称取0.2g盲肠内容物，使用PowerSoilDNAIsolationKit提取细菌总DNA，用DNA纯化试剂盒纯化，再用Nanodrop检测纯化后的DNA浓度和总量。PCR预扩增方法筛选合格样本，设计引物对（正向引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3‘；反向引物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）与衔接子序列和条形码序列组合扩增细菌16SrRNA基因的V3~V4区域。PCR的反应体系：扩增在50pL的总体积中进行，包含10pLBuffer,0.2pLQ5High-FidelityDNAPolymerase,10pLHighGCEnhancer,1pLdNTP,各1pL引I物和60ng总DNA,ddH2O补足50pL。反应条件：95C下初始变性300s，随后95C60s,50C复性60s,72C60s，最终72C延伸，进行15个循环，持续7min。通过QubitTMdsDNAHS试剂定量所有PCR产物并且合并在一起。使用IlluminaHiSeq2500平台（2x250对末端）对纯化的合并样本进行细菌rRNA基因的高通量测序分析。总DNA提取PCR扩增和测序由北京范德生物有限公司协助完成。1.4数据分析HiSeq测序得到的原始图像数据档经CASAVA碱基识别分析转化为RawReads，去除两端Barcode和Primer序列，使用FLASH软件将Readl和Read2的overlap拼接为RawTags，使用Qiime进行质控，截断含5个以上连续N或低质量碱基的序列，进一步过滤连续高质量碱基长度小于序列长度75%的Tags，从而获得CleanTags，采用UCHIME算法检定并去除CleanTags中的嵌合体，获得EffectiveTags，质控合格的EffectiveTags用于后续生物信息分析。数据处理与分析采用SPSS21.0统计软件的单因素方差分析(one-wayANOVA)和最小显著差数(LSD)法进行，试验数据表示为平均值士标准差(mean士SD)，分别以Pv0.05和Pv0.01作为差异显著和极显著的判断标准。2结果与分析犬源复合益生菌对脾气虚犬体征、体重和部分血常规指标的影响饲养试验期间，对照组试验犬食欲正常，体重基本不变，精神状态良好，毛色有光泽。与对照组相比，脾气虚组试验犬在第1天出现食欲下降、喜卧不动、眼神黯淡等特征，第7天出现平均体温略降低、粪便溏泄、精神倦怠和眯眼等明显的脾气虚症状，该组试验犬于第7天已经剖检，因此第14天无相关试验数据。益生菌治疗组试验犬经7d的犬源复合益生菌治疗后，粪便正常且精神和食欲状态明显改善。自然恢复组试验犬食欲和精神状态有好转，但较益生菌治疗组恢复缓慢，部分试验犬仍有精神倦怠、腹泻等脾气虚症状，试验结束后也未完全恢复至对照组和益生菌治疗组试验犬状态。由表2可知，第0天，4个组试验犬的体重与血常规中白细胞数、红细胞数和血红蛋白含量差异均不显著(P>0.05)。第7天，脾气虚组、自然恢复组和益生菌治疗组试验犬的体重与血常规中白细胞数、红细胞数和血红蛋白含量均极显著低于对照组(PvO.01)。第14天，益生菌治疗组与对照组试验犬的体重与血常规中白细胞数、红细胞数和血红蛋白含量相比无显著差异(P>0.05)，自然恢复组上述指标仍显著低于对照组(PvO.05)。2.2数据质量及操作分类单元(OTU)水平分析对照组、脾气虚组、自然恢复组和益生菌治疗组共采集盲肠内容物样本16个。采用Illumina高通量测序获得样本原始序列数据后进行数据过滤、拼接、质控，平均每个样本得到65096条高质量序列，平均长度为465nt。本试验Q30大于93.83%，说明测序数据可信度高。为研究盲肠菌群组成及多样性信息，使用Usearch方法进行OTU聚类，将相似性达到97%的序列聚类成一个OTU，得到所有16个盲肠内容物样本的OTU数为982，由图1可知，对照组、脾气虚组、自然恢复组和益生菌治疗组4组共有的OTU数为87，对照组独有的OTU数为36，脾气虚组独有的OTU数为7，自然恢复组独有的OTU数为16，益生菌治疗组独有的OTU数为38。对照组OTU总数为287，与脾气虚组共有的OTU数为148，说明健康犬患脾气虚证后，肠道细菌物种会随之发生改变。益生菌治疗组OTU总数为291,与对照组共有OTU数为188，说明复合益生菌制剂可提高脾气虚犬肠道细菌物种多样性，但与对照组犬肠道细菌物种略有差异，推测可能与复合益生菌制剂有优化肠道菌群分布的功能相关。表2犬源复合益生菌对脾气虚犬体质量和部分血常规指标的影响Table2Effectsofcanine-derivedcompoundprobioticsonbodyweightandpartialbloodroutineindexesinsplenicqiastheniacanines项目Items时间Time体重Bodyweight/(kg/只)白细胞数WBCcount/(x109/L)红细胞数RBCcount/(x1012/L)血红蛋白含量HGBcontent/(g/L)对照组Controlgroup第0天Day010.79±1.17a11.35±0.71a7.40±0.54a146.72±2.02a第7天Day710.69±1.72Aa11.25±0.84a7.25±0.91Aa146.55±3.85Aa第14天Day1410.80±1.27Aa10.94±2.54a7.12±1.60Aa150.75±22.79Aa脾气虚组Splenicqiastheniagroup第0天Day010.56±1.10a9.33±1.13a7.07±0.81a148.33±6.01a第7天Day79.35±0.97Bb9.73±2.15b5.34±3.16Bb120.77±10.32Bb自然恢复组Naturalrecoverygroup第0天Day010.63±1.07a7.68±1.50a7.32±0.36a148.33±13.61a第7天Day79.39±0.64Bb8.65±0.98b5.55±2.24Bb124.25±7.08Bb第14天Day1410.04±0.85Ab10.45±1.16b6.45±2.96Ab136.59±30.86Ab益生菌治疗组Probioticstreatmentgroup第0天Day010.74±1.06a8.85±2.01a7.45±1.27a147.75±9.59a第7天Day79.36±0.87Bb7.45±5.16b5.75±1.54Bb126.95±4.58Bb第14天Day1410.57±0.92Aab6.47±3.16ab6.94±1.11Aab143.75±65.26Aab同一时间不同组，数据肩标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(Pv0.01)。Amongdifferentgroupsinthesametime,valueswiththesamesmalllettersuperscriptsmeannosignificantdifference(P>0.05),whilewithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(Pv0.05),andwithdifferentcapitallettersuperscriptsmeansignificantdifference(Pv0.01).A:对照组；B:脾气虚组；C:自然恢复组；D:益生菌治疗组。下图同。A:controlgroup;B:splenicqiastheniagroup;C:naturalrecoverygroup;D:probioticstreatmentgroup.Thesameasbelow.图1OTU韦恩图Fig.1VenndiagramofOTU物种累积曲线分析物种累积箱曲线可用来比较不同测序数据量样本中物种的丰富度，也可以用来说明该样本的测序数据量是否合理。图2中，随着样本测序数据量的增加，曲线趋向于平坦，说明本试验样品测序数据量合理，可用于试验分析。图2物种累积曲线Fig.2Accumulationcurvesofspeciesa多样性分析利用a多样性指数可对单个样本的物种多样性进行分析，包括ACE指数、Chaol指数、Shannon指数以及Simpson指数等，前面3个指数越大，最后1个指数越小，说明样本中物种越丰富。本试验中每个样本的覆盖度(Goods-coverage)都在0.996以上，表明样本的测序深度和广度都达到要求。对照组与益生菌治疗组的ACE指数、Chaol指数、Shannon指数均高于脾气虚组与自然恢复组，同时益生菌治疗组高于对照组，自然恢复组高于脾气虚组；对照组与益生菌治疗组的Simpson指数均低于脾气虚组与自然恢复组，且益生菌治疗组低于对照组，自然恢复组低于脾气虚组。这说明益生菌治疗组的盲肠菌群丰度及多样性最高，脾气虚组盲肠菌群丰度及多样性最低。图3a多样性Fig.3adiversityp多样性分析主坐标分析(PCoA)是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，图4为基于UnweightedUnifrac距离的PCoA，横坐标表示一主成分，纵坐标表示另一个主成分，主坐标1(PC1)为第1主成分，表示主成分对样品差异的贡献值为38.78%，主坐标2(PC2)为第2主成分，贡献值为16.36%。如图4所示，4个组的16个样本较明显分开，组内样本聚集在一起，说明组内菌群组成相似，组间菌群组成存在明显差异，即同一组中的试验犬盲肠菌群组成相似，不同组间试验犬盲肠菌群组成存在较明显的组间差异。物种及其丰度分析门水平上的优势菌群分布根据OTU分类分析结果，在门水平上，犬盲肠菌群主要分布于9个菌门，占比较大的前4个菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)以及变形菌门(Proteobacteria)，其所占比例之和占盲肠菌群的92%以上。图中每个点表示1个样本，同一组的样本使用同一种颜色和形状表示。Eachpointrepresentsasampleinthefigure,andthesamplesofthesamegrouparerepresentedbythesamecolorandshape.图4基于UnweightedUnifrac距离的主坐标分析Fig.4PCoAbasedonUnweightedUnifracdistance由表3可知，4组试验犬盲肠菌群中厚壁菌门的相对丰度无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，脾气虚组和自然恢复组拟杆菌门的相对丰度显著降低(Pv0.05)，梭杆菌门和变形菌门的相对丰度均显著升高(PvO.05)；益生菌治疗组拟杆菌门的相对丰度显著升高(PvO.05)，梭杆菌门和变形菌门的相对丰度无显著变化(P>0.05)。与脾气虚组相比，自然恢复组拟杆菌门的相对丰度显著升高(Pv0.05)，梭杆菌门和变形菌门的相对丰度均无显著变化(P>0.05)；益生菌治疗组拟杆菌门的相对丰度极显著升高(Pv0.01)，梭杆菌门的相对丰度极显著降低(Pv0.01)，变形菌门的相对丰度显著升高(Pv0.05)。与自然恢复组相比，益生菌治疗组拟杆菌门的相对丰度显著升高(Pv0.05)，梭杆菌门和变形菌门的相对丰度均显著降低(Pv0.05)。表3门水平上的优势菌群分布Table3Distributionofdominantmicrofloraatphylumlevel%项目Items对照组Controlgroup脾气虚组Splenicqiastheniagroup自然恢复组Naturalrecoverygroup益生菌治疗组Probioticstreatmentgroup厚壁菌门Firmicutes31.82±2.4126.13±12.1425.57±2.2136.65±13.07拟杆菌门Bacteroidetes26.28±10.84ABb17.13±3.31Bd21.63±13.39ABc31.59±2.42Aa梭杆菌门Fusobacteria21.95±9.96ABb36.96±4.26Aa34.04±17.13ABa16.30±9.67Bb变形菌门Proteobacteria7.71±3.79b14.31±6.18a15.13±5.34a10.39±5.06b同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(PvO.O5)，不同大写字母表示差异极显著(P>0.01)。下表同。Inthesamerow,valueswithnoletterorthesamesmalllettersuperscriptsmeannosignificantdifference(P>0.05),whilewithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(Pv0.05),andwithdifferentcapitallettersuperscriptsmeansignificantdifference(P>0.01).Thesameasbelow.纲水平上的优势菌群分布基于OTU分类分析结果，在纲水平上，犬盲肠菌群主要分布于10个菌纲，占比较大的前7个菌纲为拟杆菌纲(Bacteroidia)、梭杆菌纲(Fusobacteria)、芽抱杆菌纲(Bacilli)、梭菌纲(Clostridia)、p-变形菌纲(Betaproteobacteria)、Y-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria)。其中，芽抱杆菌纲和梭菌纲属于厚壁菌门，拟杆菌纲属于拟杆菌门，梭杆菌纲属于梭杆菌门，放线菌纲属于放线菌门，P-变形菌纲和Y-变形菌纲属于变形菌门。由表4可知，4组试验犬盲肠菌群中梭杆菌纲、梭菌纲、「变形菌纲和放线菌纲的相对丰度均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，脾气虚组中拟杆菌纲的相对丰度显著降低(PvO.05)，芽抱杆菌纲的相对丰度极显著降低(PvO.01)，y-变形菌纲的相对丰度极显著升高(PvO.01)；自然恢复组拟杆菌纲的相对丰度显著降低(PvO.05)，芽抱杆菌纲的相对丰度极显著降低(PvO.01)，y-变形菌纲的相对丰度显著升高(Pv0.05)；益生菌治疗组芽抱杆菌纲和拟杆菌纲的相对丰度显著升高(PvO.O5)，y-变形菌纲的相对丰度无显著变化(P>0.05)。与脾气虚组相比，自然恢复组拟杆菌纲的相对丰度显著升高(PvO.05)，芽抱杆菌纲的相对丰度无显著变化(P>0.05)，y-变形菌纲的相对丰度显著降低(PvO.05)；益生菌治疗组芽抱杆菌纲和拟杆菌纲的相对丰度极显著升高(PvO.01)，Y-变形菌纲的相对丰度极显著降低(PvO.01)。与自然恢复组相比，益生菌治疗组拟杆菌纲的相对丰度极显著升高(PvO.01)，芽抱杆菌纲的相对丰度显著升高(PvO.O5)，y-变形菌纲的相对丰度极显著降低(PvO.01)。目水平上的优势菌群分布根据OTU分类分析结果，在目水平上，犬盲肠菌群主要分布于15个菌目，占比较大的前9个菌目为拟杆菌目(Bacteroidales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、孚L杆菌目(Lactobacillales)、芽抱杆菌目(Bacillales)、梭菌目(Clostridiales)、伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)和双歧杆菌目(Bifidobacteriales)。其中，乳杆菌目、芽抱杆菌目、梭菌目和丹毒丝菌目属于厚壁菌门，拟杆菌目属于拟杆菌门，梭杆菌目属于梭杆菌门，肠杆菌目和伯克霍尔德式菌目属于变形菌门，双歧杆菌目属于放线菌门表4纲水平上的优势菌群分布Table4Distributionofdominantmicrofloraatclasslevel%项目Items对照组Controlgroup脾气虚组Splenicqiastheniagroup自然恢复组Naturalrecoverygroup益生菌治疗组Probioticstreatmentgroup拟杆菌纲Bacteroidia22.64±1O.33ABb5.87±O.17Bd16.57±1O.21ABc26.68±13.O1Aa梭杆菌纲Fusobacteria16.95±4.O626.94±4.2723.O4±18.271O.O6±1.69芽抱杆菌纲Bacilli26.54±0.27Ab10.84±0.25Bc14.93±0.14Bc33.58±0.27Aa梭菌纲Clostridia10.54±0.2418.58±0.3712.58±0.7014.84±0.97p-变形菌纲Betaproteobacteria4.79±0.504.49±3.845.14±2.281.62±0.13Y-变形菌纲Gammaproteobacteria3.97±2.96Bc12.14±6.31Aa8.38±1.73ABb4.99±1.57Bc放线菌纲Actinobacteria1.47±0.121.97±1.414.42±0.062.27±0.91由表5得出，4组试验犬盲肠菌群中梭杆菌目、芽孢杆菌目、梭菌目、伯克霍尔德氏菌目、丹毒丝菌目、双歧杆菌目和肠杆菌目的相对丰度均无显著差异(P>0.05)与对照组相比，脾气虚组乳杆菌目的相对丰度极显著降低(PvO.01)，拟杆菌目的相对丰度显著降低(PvO.05)，肠杆菌目的相对丰度显著升高(PvO.05)；自然恢复组乳杆菌目的相对丰度极显著降低(PvO.01)，拟杆菌目的相对丰度显著降低(PvO.05)，肠杆菌目的相对丰度显著升高(PvO.O5)；益生菌治疗组乳杆菌目和肠杆菌目的相对丰度均无显著变化(P>0.05)，拟杆菌目的比例显著升高(PvO.O5)。与脾气虚组相比，自然恢复组乳杆菌目和拟杆菌目的相对丰度均无显著变化(P>O.O5)，肠杆菌目的相对丰度极显著降低(PvO.OI)；益生菌治疗组乳杆菌目的相对丰度极显著升高(PvO.OI)，拟杆菌目的相对丰度显著升高(PvO.O5)，肠杆菌目的相对丰度极显著降低(PvO.OI)。与自然恢复组相比，益生菌治疗组乳杆菌目和肠杆菌目的相对丰度均无显著变化(P>O.O5)，拟杆菌目的相对丰度显著升高(PvO.O5)。表5目水平上的优势菌群分布Table5Distributionofdominantmicrofloraatorderlevel%项目Items对照组Controlgroup脾气虚组Splenicqiastheniagroup自然恢复组Naturalrecoverygroup益生菌治疗组Probioticstreatmentgroup乳杆菌目Lactobacillales8.44±3.53Aa3.72±O.56Bb1.35±O.13Bb1O.75±5.71Aa拟杆菌目Bacteroidales17.64±1.39b5.87±1.O6c6.65±1.O6c2O.58±4.21a伯克霍尔德氏菌目Burkholderiales4.49±3.845.14±5.282.79±O.531.62±2.33芽抱杆菌目Bacillales14.49±7.799.96±4.O211.11±3.6129.26±1.26肠杆菌目EnterobacterialesO.15±O.12Bc12.84±6.32Aa2.O1±O.1OBbO.13±O.O7Bc丹毒丝菌目Erysipelotrichales2.34±1.481.06±0.110.31±0.201.45±1.26梭杆菌目Fusobacteriales22.92±10.9628.93±4.2418.04±1.2623.30±9.79双歧杆菌目Bifidobacteriales8.15±0.960.42±0.131.88±1.347.46±0.34科水平上的优势菌群分布根据OTU分类分析结果，在科水平上，犬盲肠菌群主要分布于19个菌科，占比较大的前10个菌科为产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、梭菌科(Clostridiaceeae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、消化球菌科(Peptostreptococcaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、疣微菌科(Ruminococcaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和螺旋体科(Spirochaetaceae)。其中，梭菌科、乳杆菌科、消化球菌科和毛螺旋菌科属于厚壁菌门，拟杆菌科属于拟杆菌门，梭杆菌科属于梭杆菌门，产碱杆菌科属于变形菌门，双歧杆菌科属于放线菌门，疣微菌科属于疣微菌门，螺旋体科属于螺旋体门。由表6可知，4组试验犬盲肠菌群中产碱杆菌科、梭菌科、梭杆菌科、乳杆菌科、消化球菌科、双歧杆菌科、疣微菌科和毛螺旋菌科的相对丰度均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，脾气虚组和自然恢复组拟杆菌科的相对丰度显著降低(Pv0.05)，螺旋体科的相对丰度显著升高(Pv0.05)；益生菌治疗组拟杆菌科的相对丰度显著升高(PvO.05)、螺旋体科的相对丰度无显著变化(P>0.05)。与脾气虚组相比，自然恢复组拟杆菌科的相对丰度显著升高(PvO.05)，螺旋体科的相对丰度显著降低(PvO.05)；益生菌治疗组拟杆菌科的比例极显著升高(PvO.01)，螺旋体科的相对丰度显著降低(Pv0.05)。与自然恢复组相比，益生菌治疗组拟杆菌科的相对丰度显著升高(Pv0.05)，螺旋体科的相对丰度显著降低(Pv0.05)。表6科水平上的优势菌群分布Table6Distributionofdominantmicrofloraatfamilylevel%项目Items对照组Controlgroup脾气虚组Splenicqiastheniagroup自然恢复组Naturalrecoverygroup益生菌治疗组Probioticstreatmentgroup产碱杆菌科Alcaligenaceae10.45±3.385.14±5.251.69±0.142.71±0.28拟杆菌科Bacteroidaceae15.68±0.91ABb2.82±1.93Bd8.56±6.41ABc19.23±1.13Aa梭菌科Clostridiaceeae2.33±1.8222.68±1.6313.25±2.538.96±0.18梭杆菌科Fusobacteriaceae25.92±9.9334.93±4.2641.04±18.2720.36±9.69乳杆菌科Lactobacillaceae8.81±2.233.68±0.663.18±0.8312.70±3.31消化球菌科Peptostreptococcaceae2.26±0.517.82±1.0616.96±6.415.51±7.06双歧杆菌科Bifidobacteriaceae8.34±1.500.14±0.031.31±1.0918.99±9.66疣微菌科Ruminococcaceae4.27±1.621.64±0.234.25±0.119.55±0.12螺旋体科Spirochaetaceae0.13±0.03c10.38±1.46a7.43±2.42b0.39±0.01c毛螺旋菌科Lachnospiraceae4.49±0.441.62±0.135.14±2.282.79±0.23属水平上的优势菌群分布根据OTU分类分析结果，在属水平上，犬盲肠菌群主要分布于23个菌属，占比较大的前11个菌属为乳杆菌属(Lactobacillus)、芽抱杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、消化球菌属(Peptostreptococcus)、副萨特氏菌属(Parasutterella)、普氏菌属(Prevotella)和苏黎世杆菌属(Turicibacter)。其中，乳杆菌属、苏黎世杆菌属、芽抱杆菌属、梭菌属、丹毒丝菌属和消化球菌属属于厚壁菌门，拟杆菌属和普氏菌属属于拟杆菌门，梭杆菌属属于梭杆菌门，副萨特氏菌属和伯克霍尔德式菌属属于变形菌门。由表7可知，4组试验犬盲肠菌群中乳杆菌属、丹毒丝菌属、拟杆菌属、梭杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、消化球菌属、副萨特氏菌属、普氏菌属和苏黎世杆菌属的相对丰度均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，脾气虚组芽抱杆菌属的相对丰度显著降低(PvO.O5)，梭菌属的相对丰度显著升高(PvO.O5)；自然恢复组芽抱杆菌属的相对丰度显著降低(PvO.05)，梭菌属的相对丰度显著升高(PvO.05)；益生菌治疗组芽抱杆菌属的相对丰度显著升高(PvO.05)，梭菌属的相对丰度无显著差异(P>0.05)。与脾气虚组相比，自然恢复组芽抱杆菌属和梭菌属的相对丰度均无显著变化(P>0.05)；益生菌治疗组芽抱杆菌属的相对丰度极显著升高(PvO.01)，梭菌属的相对丰度极显著降低(Pv0.01)。与自然恢复组相比，益生菌治疗组芽抱杆菌属的相对丰度极显著升高(Pv0.01)，梭菌属的相对丰度显著降低(Pv0.05)。表7属水平上的优势菌群分布Table7Distributionofdominantmicrofloraatgenuslevel%项目Items对照组Controlgroup脾气虚组Splenicqiastheniagroup自然恢复组Naturalrecoverygroup益生菌治疗组Probioticstreatmentgroup乳杆菌属Lactobacillus8.33±0.732.08±0.143.74±1.7214.74±2.13拟杆菌属Bacteroides13.34±10.125.82±1.936.59±2.2128.68±0.16梭杆菌属Fusobacterium25.46±19.6830.95±4.0932.61±18.3116.76±9.97苏黎世杆菌属Turicibacter2.28±0.597.82±1.066.91±6.414.531±2.06副萨特氏菌属Parasutterella4.88±2.041.69±0.815.14±2.282.79±0.52芽抱杆菌属Bacillus8.25±1.16ABb1.61±1.03Bc4.25±0.81Bc12.53±0.42Aa梭菌属Clostridium6.92±1.83ABc24.23±11.89Aa16.37±14.31ABab5.05±1.04Bc丹毒丝菌属Erysipelothrix0.35±0.196.42±0.861.28±0.151.14±0.13消化球菌属Peptostreptococcus1.27±0.455.89±2.0615.52±6.610.98±0.67伯克霍尔德氏菌属Burkholderia1.12±1.096.19±6.132.35±2.240.13±0.11普氏菌属Prevotella5.01±0.133.68±0.696.87±1.313.14±0.833讨论肠道菌群紊乱与脾气虚证发展密切相关［3］。临床常用微生态制剂调节脾气虚动物的胃肠微生态环境［17］。16SrRNA高通量测序分析被广泛用于微生物多样性及定性分析，可综合反映群落生态中物种丰富度和均匀度［18］。脾气虚动物肠道菌群多样性呈现下降趋势。本试验结果中发现脾气虚组试验犬盲肠菌群的Chaol指数、ACE指数和Shannon指数均低于对照组，脾气虚犬经犬源复合益生菌治疗后，上述指数显著高于对照组，说明脾气虚犬盲肠菌群多样性低于对照组，经益生菌治疗后盲肠菌群多样性高于对照组。肠道内的菌群形成了错综复杂的微生态系统，直肠和盲肠食糜中含菌量高达109-1010CFU/g［19］。Suchodolski等［20］对6只健康犬盲肠内容物基因测序，与SILVA基因库比对（相似性98%）后发现，4大优势菌门为厚壁菌门、梭杆菌门、拟杆菌门和变形菌门，盲肠菌群中梭杆菌门和拟杆菌门各占1/3Middelbos等［21］利用454高通量测序技术检测犬肠道菌群，结果显示优势菌门为厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门。本试验中，犬盲肠菌群中优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和变形菌门，对照组、脾气虚组、自然恢复组和益生菌治疗组四大菌门之和分别占盲肠菌群的87.84%、94.53%、96.37%和94.93%，说明未被检测率较低。本研究发现不同分类等级中，益生菌治疗组拟杆菌门、纲、目、科以及芽孢杆菌纲、属的相对丰度均显著高于对照组和脾气虚组，且脾气虚组显著低于对照组。拟杆菌是肠道厌氧菌群中的优势菌，有学者发现拟杆菌能帮助宿主分解多糖、提高营养利用率、加快肠黏膜修复、促进免疫系统发育及维持肠道微生态平衡［22］。芽孢杆菌能够产生多种脂肽类抗菌物质，抑制病原菌生长和繁殖［23］。此外，对照组和益生菌治疗组乳杆菌目的相对丰度均显著高于脾气虚组。乳杆菌提供机体部分所需维生素、必需氨基酸和酶类，维持酸性环境，通过黏附抗性和竞争定植，进而抑制并清除肠道病原菌等有害物质［24］。变形菌是常见的条件致病菌，可以引起患者消化道及泌尿道感染［25］。梭菌属中的丁酸梭菌可改善肠道菌群分布，提高免疫功能；艰难梭菌、产气荚膜梭菌和破伤风梭菌等的存在有损宿主健康［26］。宿主体内微生态失调时，梭杆菌可能造成肠道癌症[25]。螺旋体的致病机制尚不明确，钩端螺旋体的致病性可能与其产生的溶血素、细胞毒因子及内毒素样物质有关；梅毒螺旋体的致病性则与其表面夹膜样物质的黏附作用及自身分泌的黏多糖酶的作用有关[27]。本试验结果显示，脾气虚组梭杆菌门、Y-变形菌纲、肠杆菌目、螺旋体科和梭菌属的相对丰度均高于对照组，而益生菌治疗组则低于对照组，表明犬源复合益生菌不仅能帮助脾气虚犬盲肠菌群多样性恢复到对照组水平，并且可使盲肠中有益菌占比优于正常犬。从本试验中这些菌群组成比例的改变来看，脾气虚犬经犬源复合益生菌治疗后取得了良好效果，其盲肠菌群多样性优于正常犬。本试验使用番泻叶法成功造出犬脾气虚模型，对深入探讨犬源复合益生菌对脾气虚证患者肠道内源微生物群作用机制及临床应用有参考意义4结论综上所述，犬源复合益生菌不仅能够使番泻叶诱导的脾气虚犬盲肠菌群多样性恢复至正常犬水平，而且还能提高盲肠菌群中有益菌拟杆菌、芽孢杆菌的占比，对脾气虚犬盲肠菌群结构有良好的调节作用。参考文献：【相关文献】[1]KAJANDERK,HATAKKAK,POUSSAT,etal.Aprobioticmixturealleviatessymptomsinirritablebowelsyndromepatients:acontrolled6-monthintervention[J].AlimentaryPharmacologyandTherapeutics,2005,22(5):387-394.冯文林伍海涛•从肠道菌群探讨多种疾病从脾论治的机理J].吉林中医药,2018,38(10):14-17.ROOKSMG,GARRETTWS.Gutmicrobiota,metabolitesandhostimmunity[J].NatureReviewsImmunology,2016,16(6):341-352.PENGY,WANGZ,LUY,etal.Intestinalmicrofloramolecularmarkersofspleen-deficientratsandevaluationoftraditionalChinesedrugs[J].WorldJournalofGastroenterology,2009,15(18):2220-2227.⑸彭颖，李晓波•脾虚证与肠道微生态[几世界华人消化杂志,2012,20(34):3287-3291.SANDERSME,MERENSTEIND,MERRIFIELDCA,etal.Probioticsforhumanuse[J].NutritionBulletin,2018,43(3):212-225.DICKSLMT,GELDENHUYSJ,MIKKELSENLS,etal.Ourgutmicrobiota:alongwalktohomeostasis[J].BeneficialMicrobes,2018,9(1):3-20.SNCHEZB,DELGADOS,BLANCO-MIGUEZA,etal.Probiotics,gutmicrobiota,andtheirinfluenceonhosthealthanddisease[J].MolecularNutrition&FoodResearch,2017,61(1),doi:10.1002/mnfr.201600240.罗云坚，修宗昌,黄穗平，等•脾气虚证免疫相关基因组学机制初探J].中国中西医结合杂志,2005,25(4):311-314.HODK,DEKELR,AVIVCOHENN,etal.Theeffectofamultispeciesprobioticonmicrobiotacompositioninaclinicaltrialofpatientswit