基因表达及功能分析的基本策略

第四讲

基因表达及功能分析的基本策略STRATEGIESFORANALYZINGGENEEXPRESSIONANDFUNCTION第一节基因表达分析的策略第二节生物信息学在预测基因功能中的应用第三节基因的生物学功能鉴定技术第一节基因表达分析的策略StrategiesforAnalyzingGeneExpression（一）基于杂交原理的方法可检测mRNA表达水平1．Northern印迹（Northernblot）既可分析mRNA表达又可验证cDNA新序列是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA分析技术一、通过检测mRNA揭示基因转录水平的表达特征与DNA印迹（

Southernblotting）原理相同用于检测RNA无需限制性内切酶切割用途：已知的特异mRNA表达水平；比较不同组织或细胞的同一基因表达情况。

RNA印迹技术:Northern

blottingNorthern印迹分析原理示意图2.Dotblotting:斑点印迹（直接将样品点在NC膜上用于杂交分析）可对mRNA进行区域定位。

是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技术。通过设计与目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列作为标记。该技术被广泛用于组织中的基因表达分析，具有较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。3．原位杂交（insituhybridization，ISH）原位杂交Insituhybridization检测核酸检测蛋白质组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析（二）两种聚合酶链式反应是常用的mRNA检测方法1．反转录PCR可用于mRNA的半定量分析。

反转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被实时定量PCR替代。Markergroup1group2

controlTargetgene常用于mRNA的定量分析。实时定量PCR(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。2．实时定量PCRRealtimePCRNoprobe:fluorescentdye(SYBRgreen)probes1.TaqManprobe

2.Molecularbeaconsprobe

3.FRETprobe

QuantitativePCRNeedfluorescentdyeorprobelabeledfluorescenceTypes:

TaqMan探针法实时PCR原理示意图R:reporterQ:quencherSYBRGreen实时定量PCR分析原理示意图（三）用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于对不同状态下的基因表达谱进行比较，揭示转录组差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。E.G.:Genechipisusedintheanalysisofgeneexpressioninnormaltissueandtumortissue.two-colorfluorescentprobehybridizationN:greenT:redNandT:yellowGenechipisusedintheanalysisofgeneexpressionindifferenttissues.二、通过检测蛋白质揭示基因翻译水平的表达特征

Western印迹（Westernblot）是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。（一）采用特异抗体经Western印迹可直接测定基因编码多肽蛋白质印迹（WesternBlotting）1.蛋白质样品2.聚丙烯酞胺凝胶电泳分离3.电转移至NC膜4.特异抗体（一抗）做探针5.辣根过氧化物酶标记或同位素标记第二抗体。6.检测样品中特异性蛋白质的存在，特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。转膜Protein

HRPDABH2O21Ab2Ab洗膜、显色

酶联免疫吸附分析（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质分析基本方法。该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样品包被在支持体上，以后反应过程与Western印迹大致相同——顺序结合（即“吸附”）特异抗体（一抗）及与酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。（二）酶联免疫吸附分析与Western印迹原理相似但形式不同特点：具有特异性；灵敏度很高；稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，尤其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；既可以做定性试验也可以做定量分析。被广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和免疫学等领域。酶联免疫吸附分析

免疫组织化学（immunohistochemistry）与免疫细胞化学（immunocytochemistry）原理相同，都是利用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。（三）免疫组化实验可对组织/细胞表达的蛋白质进行原位检测免疫组织化学照片免疫细胞化学

流式细胞术（flowcytometry）在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。（四）流式细胞术用于分析

表达特异蛋白质的阳性细胞流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对多个基因产物进行标记和监测，是对细胞进行快速分析、分选、特征鉴定的一种有效方法。PSAPSA+TauP301L第二节生物信息学在预测基因功能中的应用

BioinformaticsApplicationinPredictingGeneFunction一、利用生物信息学方法进行基因功能注释(一）通过序列比对预测基因功能序列比对是生物信息学最基本的分析技术之一，最常用的方法是将目的DNA或蛋白质序列与已知的DNA和蛋白质序列数据库进行比对，搜索到与目的序列高度同源的功能已知的基因或蛋白质，用这些基因和蛋白质预测目的基因和蛋白质的功能。BLAST是一个序列数据库搜索程序家族，其中包括许多有特定用途的程序。程序查询序列类型数据库类型注BLASTNDNADNABLASTP蛋白质蛋白质BLASTXDNA蛋白质将待搜索的核酸序列按6个阅读框翻译成蛋白质序列，然后与数据库中的蛋白质序列比对TBLASTN蛋白质DNA将数据库中的核酸序列按6个阅读框翻译成蛋白质序列，然后与待搜索的蛋白质序列比对TBLASTXDNADNA无论是待搜索的核酸序列还是数据库中的核酸序列都按6个阅读框翻译成蛋白质序列，然后比对BLAST序列数据库搜索程序家族（二）利用生物信息学方法分析基因芯片数据最常用的方法有：差异表达分析（又称基因表达差异分析）聚类分析差异表达分析的目的：识别两个条件下表达差异显著的基因，即一个基因在两个条件中的表达水平，在排除各种偏差后，其差异具有统计学意义倍数分析：计算每个基因在两个条件下的表达比值；统计分析中的t检验和方差分析：通过计算表达差异的置信度来分析差异是否具有统计学意义；建模的方法：通过确定两个条件下的模型参数是否相同来判断表达差异的显著性。差异表达分析常用的分析方法有3类：聚类分析所依据的基本假设：

若组内基因具有相似的表达模式，则它们可能具有相似的功能，例如受共同的转录因子调控的基因，或者产物构成同一个蛋白复合体的基因，或者参与相同调控路径的基因。在具体应用中可按照相似的表达谱对基因进行聚类，从而预测组内未知基因的功能。

在氨基酸序列整体同源性不明显的情况下，对蛋白质的功能域进行分析将对预测基因功能提供极其有价值的信息。通过多序列比对，分析蛋白质结构中的保守区域或序列，如结构域（domain）和模体（motif），这些共享结构域和保守模体通常与特定的生物学活性相关，反映了蛋白质分子的一些重要功能。

（三）通过生物信息学方法分析蛋白质结构来预测蛋白质功能基因组功能注释常用数据库数据库网址描述AAT基因组分析和注释工具COG直系同源体簇分析数据库EcoCyc大肠杆菌的基因与代谢OMIM在线人类孟德尔遗传资料PEDENT完整基因组的生物信息学分析SAS结构为基础的基因组序列分析WIT基因组代谢途径重构

现在人们已经越来越清楚地认识到，生物功能大多不是只由一个或几个基因控制的，而是通过生物体内众多的分子（如DNA、RNA、蛋白质和其他小分子物质）共同构成的复杂生物网络实现的。当前生物学面临的巨大挑战之一就是，了解生物体内复杂的相互作用网络以及它们的动态特征。目前人们已经利用生物技术和信息技术建立了各种生物网络数据库和网站，可为研究者提供基因调控、信号转导、代谢途径、蛋白质相互作用等方面的信息。二、利用生物网络全面系统地了解基因的功能常用基因转录调控数据库数据库网址描述EPD真核生物启动子数据库包含已被实验证明的转录起始位点和组织特异性等启动子的一般信息TFD转录因子数据库是转录因子及其特性的专门数据库，收集有关多肽相互作用信息TRANSFAC数据库提供转录因子结构、功能、序列、DNA结合谱以及分类，还包括基因的转录因子结合位点的信息TRRD转录调控区数据库收集了关于真核基因整个调控区分级结构和基因表达模式的信息

（一）利用生物网络研究基因表达调控常用信号通路数据库数据库网址描述Biocarta信号通路图片及注释数据库Reactome生物核心通路及反应的挖掘知识库PID从其他数据库导入及文献挖掘的人信号通路数据库STKE参与信号转导的分子及其相互作用关系的信息AfCS参与信号通路的蛋白质相互作用和信号通路图DOQCS细胞信号通路的量化数据库,提供反应参数及注释信息SigPath提供细胞信号通路的量化信息

（二）利用生物网络研究信号转导常用代谢网络数据库数据库网址描述KEGG包括了700个以上物种的代谢、信号转导、基因调控、细胞过程的通路BioCyc包括了260个物种的代谢通路及基因组数据PUMA2存放了预先计算的超过200个物种的代谢通路信息BioSilico整合信息的数据库，提供对多个代谢数据库的访问

（三）利用生物网络研究代谢途径常用蛋白质互作网络数据库数据库网址描述BIND提供参与通路的分子的序列和相互作用信息DIP专门存放实验确定的蛋白质之间相互作用的数据,既包括经典实验手段也包括高通量实验手段确定的蛋白质相互作用数据STRING存储实验确定的和预测得到的蛋白质相互作用数据，并对各种预测方法得到的结果的准确性给出了相应的权重MIPS包括酵母和哺乳动物的PPI,可靠性很高,被作为准金标准使用YeastInteractome综合多种来源的由酵母双杂交技术确定的酵母PPI数据集,利用基因表达信息、蛋白亚细胞定位信息以及已知的各种知识对其进行验证形成高可信度的相互作用数据（四）利用生物网络研究蛋白质相互作用第三节基因的生物学功能鉴定技术MethodsforIdentifyingBiologicalFunctionsofGenes生物信息学利用已知数据和生物学知识进行合理推断,可以节省大量的人力物力，但基因功能的鉴定最终仍需要通过实验来验证。通常采用基因功能获得和/或基因功能缺失的策略，观察基因在细胞或生物个体中的，细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，来鉴定基因的功能。由于基因的功能必须在完整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现，因此从整体水平研究基因的功能是必然的选择。基因功能获得策略即通过将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因的功能。常用的方法有转基因和基因敲入技术等。一、采用功能获得策略鉴定基因的功能转基因技术：用实验方法，把外源目的基因（转基因）整合到动物受精卵细胞或胚胎干细胞的基因组中，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体（转基因动物）。并把目的基因遗传给子代的动物。这种个体能够把目的基因继续传给子代。转基因小鼠、转基因大鼠、转基因羊。（一）用转基因技术获得基因功能

转基因动物（transgenicanimal）是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物。其基本制作过程包括：转基因表达载体的构建，外源基因的导入，转基因动物的获得和鉴定，转基因动物品系的建立以及外源基因表达分析鉴定。1.转基因动物可在整体水平研究基因的功能世界上第一只转基因动物巨鼠，是将大白鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵中，再将这个受精卵移入借腹怀胎的母鼠子宫中，产下小白鼠比一般的大一倍。这只在遗传学上具有重大意义的转基因动物的研究培育成功，展现出诱人的光明前景。

优点：利用转基因动物模型研究外源基因，能够接近真实地再现基因表达所导致的结果，及其在整体水平的调控规律，把复杂的系统简单化，具有系统性和独立性，是目前层次最高的实验体系。利用转基因技术建立的疾病动物模型具有遗传背景清楚、遗传物质改变简单、更自然更接近疾病的真实症状等优点。但转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题：外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插入突变，破坏宿主基因组功能；外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等；整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传等。虽然转基因技术本身仍存在一些问题，但其在医学研究中的重要地位是毋庸置疑的，随着转基因技术的不断完善，其在医学及生物学领域必将有更加广泛的应用。（二）基因敲入可以实现基因的定向插入

基因敲入(geneknock-in)是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因,或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。通过基因敲入，可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲入是基因打靶技术的一种，基因打靶技术是20世纪80年代后半期发展起来的，一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。该技术的巧妙之处在于把胚胎干细胞技术和DNA同源重组技术“结合”起来，实现对染色体上某一基因的定向修饰和改造，从而深入地了解基因的功能。除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等。基因功能研究的功能失活策略是通过观察，细胞或个体的某一基因功能被部分或全部失活后，细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化，来鉴定基因的功能。常用的方法主要有：基因敲除基因沉默二、采用功能失活策略鉴定基因的功能

基因敲除（geneknock-out）属于基因打靶技术的一种，其操作步骤和原理与基因打靶技术相同。先获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯和个体。1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。（一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：有些重要的靶基因被完全敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能。近年来，条件性基因打靶（conditionalgenetargeting）系统的建立，使得对基因打靶的时间和空间上的操作更加明确，可以在不同发育阶段和不同器官、组织的选择性敲除。这一技术亦存在一些缺点：费用太高周期较长许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这些基因的功能为其他基因代偿所致条件性基因打靶的优势：克服了重要基因被敲除所导致的早期致死能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及疾病发生、治疗过程中的作用和机制

基因沉默(genesilencing)是指由外源基因导入引起的生物体内的特定基因不表达或表达受抑制的现象。

目前最常用的基因沉默技术包括：RNA干扰（RNAinterference，RNAi）反义寡核苷酸（antisense

oligonucleotide，ASON）（二）基因沉默可以使基因的功能部分缺失

RNAi是指双链RNA介导同源序列的mRNA特异性降解，导致的转录后基因沉默。

RNAi是机体的一种天然防御机制，具有防御病毒感染、入侵等功能。

RNAi能够在短时间内高效特异地抑制靶基因表达，从而研究基因的功能。1.RNA干扰技术可用来研究基因的功能RNAi的作用机制：

外源dsRNA可直接被导入细胞，或者通过转基因、病毒感染等方式进入细胞，各种来源的dsRNA被特异识别dsRNA的Dicer酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割成长约21~23nt的双链小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)；siRNA识别mRNA链上的同源区域之后，形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducesilencingcomplex，RISC）；RISC定位到靶mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。

RNAi的作用机制示意图目前有几种方法可用于制备siRNA：化学合成法体外转录法长链dsRNA的RNaseⅢ体外消化法