丙泊酚对过氧化氢诱导人红细胞衰亡的影响

丙泊酚对过氧化氢诱导人红细胞衰亡的影响目的红细胞在体内和体外受环境因素刺激会出现类似有核细胞凋亡现象,表现为膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外露,细胞皱缩体积变小、细胞膜囊泡化,这种现象与衰老的红细胞表现极为相似。为了与有核细胞凋亡相区别,称其为衰亡(eryptosis)。衰亡的红细胞可被巨噬细胞识别、吞噬,避免了溶血释放血红蛋白引起的组织器官损伤,但衰亡使红细胞寿命缩短,严重时会引起贫血。过氧化氢(H2O2)是否会引起人红细胞衰亡?对红细胞一氧化氮(NO)、亚硝酸盐(NO2-)和硝酸盐(NO3-)代谢有什么影响?丙泊酚(propofol,PPF)对人红细胞衰亡以及NO、NO2-和NO3-代谢的影响是什么?为了解释这些问题,本实验设计：①用H2O2建立体外氧化应激诱导人红细胞衰亡模型；②观察不同剂量PPF对氧化应激诱导人红细胞衰亡的影响；③检测细胞内NO、NO2-和NO3-含量的变化；④探讨丙泊酚对人红细胞的保护作用和抗氧化损伤机制。方法第一部分：H202诱导红细胞衰亡模型的建立。从健康志愿者全血提纯红细胞,制备成2%红细胞悬液,使悬液含(mmol/1):氯化钠145,氯化钾4,氯化钙2,葡萄糖5,PH=7.4。红细胞悬液分成6组(n=3)：空白对照组(C),H2O25μm/1组(H5O),H2O2100μm/1组(H100),H2O2200μm/1组(H200),H2O2400μm/1组(H400)及离子霉素(Ionomycin)0.1μmol/L组(Ion)。Ion组孵育15分钟,其余各组孵育3小时。应用酶标分析仪检测红细胞溶血率,应用流式细胞仪检测各组红细胞PS标记率和前向角值(forwardandscatter,FSC)。根据这三项指标确定研究模型。第二部分：PPF预处理对红细胞衰亡及NO代谢的影响。实验组设置：取制备2%红细胞悬液分为6组(n=4)：①对照组(C)；②H202组(H)；③丙泊酚10μmol/L+H202组(P12.5+H)；④丙泊酚25μmol/L+H202组(P25+H)；⑤丙泊酚50μmol/L+H202组(P50+H)；⑥丙泊酚100μmol/L+H202组(P12.50+H)组。后4组依次用反应浓度为12.5、25、50、100μmol/L的丙泊酚预处理30min再加H202刺激。C组为单纯2%红细胞悬液,其余各组H2O2的反应浓度均为200μmol/L。阳性和阴性对照组的设置(n=4)：以离子霉素(Ionomycin)0.1μmol/L组(Ion)和丙泊酚50μmo1/L+Ion(P50+Ion)作为PS外露和细胞体积变化的阳性对照。以英脱利匹特50μmol/L组(In50)和英脱利匹特50μmol/L+H202组(In50+H)两组为丙泊酚阴性对照,以维生素E50μmol/L组(E50)和维生素E50μmol/L+H202组(E50+H)做为清除自由基的阳性对照。各组PPF预处理时间为30分钟,均置于恒温震荡培养箱中50rpm,37℃孵育3小时。应用AnnexinV荧光染色检测各组红细胞PS标记率,FSC以及用Fluo-4/AM检测红细胞内Ca2+浓度。实验组采用Griess法,委托北京华英生物技术研究室检测红细胞内NO、NO2-和N03-含量。结果第一部分：与C组相比,H400组红细胞溶血率显著增加(P<0.05),而H50、H100、H200三组无明显溶血(P>0.05)。红细胞PS标记率H200和H400两组比C组明显增加(P<0.05),H200组FSC比C组减少明显(P<0.05)。故选择反应浓度为200μm/1的H202用于制作人红细胞氧化应激衰亡模型。第二部分：PS标记率：与H组(15.20±1.01)相比,P12.5+H、P25+H、P50+H和P100+H组的PS标记率都降低,分别为9.39±2.35、4.35±3.62、3.09±1.66和1.68±0.28,差异均具有统计意义(P<0.05)。FSC值：与H组(1767.67±9.19)相比,P12.5+H、P25+H、P50+H和P100+H四组FSC均有增加,分别是1783.83±33.26、1797.21±97.13、1810.61±16.28和1792.97±24.83,其中P50+H与H组相比,差异有统计意义(P<0.05)。Ca2+浓度：与C组相比,H组Ca2+荧光强度无明显改变(P>0.05)。与H组相比,PPF预处理各浓度组Ca2+荧光强度增加,但差异无统计意义(P>0.05)。NO含量：H组(2.40±0.02)比C组(2.99±0.05)低(P<0.05),P25+H组(3.03±0.13)和P50+H组(3.14±O.11)比H组明显改善(P<0.05),且呈剂量依赖性。NO2-含量：H组(22.54±O.14)比C组(24.01±0.33)低(P<0.05),P12.5+H组(22.93±0.16)、P25+H组(24.05±0.71)、P100+H组(27.61±2.99)均比H组高(P<0.05)。NO3-含量：H组(44.77±4.02)及PPF各浓度组均比C组(31.14±1.48)高。结论1、低剂量的H2O2能在体外诱导人红细胞衰亡,表现为PS外露、细胞体积缩小,但细胞内Ca2+浓度变化不明显;2、丙泊酚通过清除自由基保护人红细胞抵抗氧化损伤,抑制衰亡；3、H2O2诱导人红细胞衰亡不是通过Ca2+内流引起,丙泊酚对单纯Ca2+内流引起的红细胞衰亡无明显抑