小分子端粒酶抑制剂的研究进展

小分子端粒酶抑制剂的研究进展肿瘤的发生是多阶段的复杂过程，原癌基因的激活、抑癌基因的失活是肿瘤发生的重要分子根底。肿瘤细胞获得无限增殖特性而成为永生化细胞，在这个过程中端粒酶起了重要作用，端粒酶的激活使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持，避开了细胞正常的复制-衰亡机制的制约。研究发现，近90%的肿瘤细胞都有端粒酶活性，而正常细胞或组织中几乎没有检测到端粒酶活性。端粒酶已成为当今肿瘤新的标志物和肿瘤治疗的新靶点，抑制端粒酶的活性已成为肿瘤治疗的一种新策略。本文作者就近年来出现的小分子端粒酶抑制剂进行综述。1端粒和端粒酶端粒(telomere)位于真核生物染色体3'末端，是由富含鸟嘌呤的DNA重复序列和端粒结合蛋白组成的核蛋白复合物，它是染色体末端的一种特殊结构，能防止染色体DNA降解、末端融合、缺失及非正常重组，维持染色体的完整和稳定，端粒结构对于保持染色体结构的完整性具有重要意义。研究证明，端粒与细胞的寿命密切相关。细胞在进行分裂时，由于受DNA聚合酶的限制，每次分裂，染色体3'末端将持续丧失50～200b的DNA，端粒不断缩短，当其长度减小到一定的临界值时，细胞即趋向于衰老、死亡，因此，端粒被认为是绝大多数体细胞的“生物钟〞。端粒酶是一种特殊的DNA聚合酶，具有逆转录酶活性，它有3个主要组分:人端粒酶催化亚单位(thehumantelomerasereversetranscriptase，hTERT)、人端粒酶核糖核酸(hTR)，以及端粒酶相关蛋白(TP1/TLP1)。端粒酶能以自身的RNA为模板，反转录成端粒的重复单元TTAGGG加到人染色体末端，使端粒延长，阻止端粒随细胞分裂而缩短，使细胞绕过衰老途径成为永生化细胞，导致人类肿瘤的发生。一般认为，端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件，端粒酶使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持，避开了细胞正常的复制-衰亡机制的制约而获得永生性。端粒酶在大多数肿瘤细胞高表达而在正常细胞却表达很少，这使得端粒酶成为人们热衷研究的药物作用靶点。近年来，以端粒酶为靶点的抑制剂广被报道，例如:目前正处于Ⅰ期临床试验的核苷类端粒酶抑制剂GRN163L等，也有一些小分子抑制剂，如:非核苷类端粒酶抑制剂BIBR1532、吖啶类端粒酶抑制剂BRACO19、MST-312、FJ-5002等。2小分子端粒酶抑制剂2.1小檗碱及其类似物小檗碱(berberine，1)又称黄连素，是中药黄连的主要生物碱。小檗碱是一种异喹啉季铵生物碱，于1826年从Xanthoxylonclava树皮中首次获得。Naasani等人用比拟分析法对化合物数据库进行虚拟筛选，并采用端粒重复序列扩增(TRAP)法对端粒酶抑制活性进行评价，结果显示，小檗碱是一种中等强度的端粒酶抑制剂，其抑制活性的L50值约为35μmol·L-1。之后，他们又以小檗碱作为升级探针，采用比拟分析法筛选出小檗碱类似物MKT-077(2)，它对端粒酶有较强的抑制作用，L50值约为5μmol·L-1。MKT-077是一种新的含硫花青染料类抗肿瘤抑制剂，Tatsuta等人研究发现，它提供了一种新的抗癌机制，即它在癌细胞(如结肠、乳腺、胰腺癌等)线粒体上聚集，使得作用在线粒体上的亲脂性离子化合物离域。在前期研究根底上Naasani等人又以MKT-077作为升级探针进行新一轮的筛选，发现了MKT-077近亲衍生物FJ-5002(3)，其L50值为2μmol·L-1，为小檗碱的17倍，具有较强的抑制活性。研究显示，将白血病细胞U937和不同浓度的FJ-5002共同长时间培养，会引起不同程度的端粒丧失(从约10b到近4.0kb)及染色体不稳定性和老化/危像特征，而且呈现出浓度依赖性，说明FJ-5002能有效地抑制端粒酶的活性。近年来，对化合物1～3的研究报道很少，Wadhwa等人进行体内活性研究发现MKT-077没有表现出良好的端粒酶抑制活性，实验结果显示，对端粒酶抑制作用不是MKT-077诱导的癌细胞毒性作用的主要原因，因此已经停止进一步的研究。2.2苯乙烯类Kim等人对化合物库进行虚拟筛选得到3个硝基苯乙烯类化合物DPNS(4)、DNS(5)、NVN(6)，他们均表现出一定的抑制端粒酶活性(L50值分别为0.4、2.7、2.57μmol·L-1)，其中化合物DPNS(4)的活性最正确，但它对DNA聚合酶、RNA聚合酶以及逆转录酶没有抑制作用。一系列的酶动力学实验证明DPNS是一个混合型的非竞争性抑制剂，与端粒基底物以及三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)的抑制键合位点不同。在DPNS的存在下，随着肿瘤细胞株的增殖其端粒显著缺失，最终趋于衰老凋亡。由此可见，DPNS是一个高选择性的体外端粒酶小分子抑制剂，具有进一步研究开发的价值。勃林格殷格翰公司开发的芳基乙烯类端粒酶抑制剂BIBR1532(7)、BIBR1519(8)体外抑制端粒酶活性的L50值分别为93、470nmol·L-1。研究说明，BIBR1532(7)能选择性地抑制端粒酶的活性，使端粒缩短，细胞生长阻滞，限制了癌细胞的增殖。Damm等人研究发现，BIBR1532对鞍区生殖细胞瘤(GCT)衍生的细胞株2102EP细胞有显著的抑制作用。在10μmol·L-1BIBR1532条件下培养2102EP细胞株，当细胞群体倍增值(PDs)到达300时，端粒的长度从(18.5±0.59)kb降至(8.9±0.1)kb。Mueller等人研究发现，BIBR1532对颅骨软骨肉瘤细胞端粒酶具有强的抑制作用，可缩短端粒的长度，降低含端粒酶的颅骨软骨肉瘤细胞的生长能力。Parsch等人合成了与BIBR1532构型相反的化合物221-32(9)，其活性与BIBR1532相当，研究说明此类化合物的构型不是活性决定因素，这为此类化合物的作用方式研究提供了根底。2.3喹啉类多篇文献报道喹啉和异喹啉类化合物显示出良好的生物活性，尤其是在酶抑制剂中得到广泛的应用。例如:Colangelo等人报道的铂化合物ptquin8(10)具有显著的抑制端粒酶活性。体外肿瘤细胞MCF-7模型试验结果发现，在1×10-9mol·L-1和1×10-5mol·L-1的ptquin8作用下，24h后端粒酶活性分别降低了12%和46%。Kim等人报道了化合物2，3，7-三氯-5-硝基喹喔啉(TNQX，11)，它是一个混合型的非竞争性端粒酶抑制剂(L50值为0.14μmol·L-1)，它对DNA聚合酶、RNA聚合酶以及逆转录酶没有抑制作用。白叶藤碱(cryptolepine，12)是一种天然的吲哚喹啉类生物碱，此化合物及其盐酸盐在非洲曾经作为抗疟疾药物，分子水平研究证实白叶藤碱能影响DNA拓扑异构酶Ⅱ的活性。最新研究发现，一些白叶藤碱结构衍生物能与DNA的G-四链体结构相互作用并且显示出一定的端粒酶抑制活性。Zhou等人设计了一系列喹叨啉(quindoline，13)类似物14～23，以寻找新型的端粒酶抑制剂。构效关系研究说明:在喹叨啉11位引入供电子基团(如取代氨基等)，其端粒酶抑制活性显著提高(L50值:喹叨啉大于138μmol·L-1，衍生物14～23为0.44～12.3μmol·L-1)，其中化合物21(SYUIQ-5)的活性最好，其L50值为0.44μmol·L-1，在裸鼠中的药动学性质具有剂量依赖性，主要通过Cyp3A1/2进行代谢。Lu等人对SYUIQ-5进行改造，设计了26个5-N-甲基喹叨啉化合物(如24～27)，此类化合物在芳喹啉的5位带有正电荷。核磁共振以及分子模拟研究证实，化合物分布在外部G-四链体以及正电荷的引入能够增强化合物的稳定性。化合物24在一无细胞体系中能显著抑制端粒酶的活性，其对白血病细胞HL60、淋巴瘤细胞CA46增殖的长期效应实验显示，24能够诱导细胞增长的中断、细胞衰老以及端粒的缩短等过程。化合物25与不同类型的DNA有强的结合能力，与G-四链体结构的结合尤为突出。在前期研究的根底上，Tan等人以SYUIQ-5作为参考分子设计合成了4个依靛蓝酮类化合物28～31，4个化合物均表现出端粒酶抑制活性(L50值分别为7.8、9.3、9.0、15.2μmol·L-1)，用端粒限制性片段(telomericrestrictionfragment，TRF)长度法对化合物28在白血病细胞HL60、淋巴瘤细胞CA46中进行端粒酶活性评价，结果显示，在0.9μmol·L-1时HL60、CA46细胞端粒长度均发生缩短，浓度达1.8μmol·L-1时两者端粒分别缩短为1.1kb和2.3kb。2.4蒽醌类蒽醌类化合物具有泻下、抗菌消炎作用，其抗癌作用也不断被报道。自20世纪60年代意大利科学家首先研究并证实了柔红霉素及阿霉素的疗效以来，蒽醌类抗肿瘤药物得到了很大的开展，目前，已有多种蒽醌类药物应用于临床。Huang等人报道了两类双取代的蒽醌类化合物32、33，这两类化合物具有良好的抑制端粒酶活性。构效关系研究说明:当取代基R为CH2NHCH2CH3和CH(CH3)NH(CH2)3N(CH3)2时，1，5-二氨基取代蒽醌类化合物(32)的活性最好，L50值分别为5.0、2.0μmol·L-1;氮原子上烷基取代链延长、缩短，或者没有氮原子连接，活性有不同程度的降低，而1位、5位被硫原子以及酰氧基取代时，活性保持不变。当R基团为CH2NHCH2CH3时，2，6-二氨基取代蒽醌类化合物(33)的活性最正确，L50值为0.1μmol·L-1;氮原子上烷基链增长，活性略有降低(如R为CH2NHCH2CH2CH3，L50值降为2μmol·L-1)。在前期构效关系研究的根底上，Huang等人又对这类化合物做了进一步的结构改造，在蒽醌母核的1、2位拼上氮杂环结构，得到系列化合物34，该系列化合物虽然只具有中等端粒酶抑制活性，但却显示出良好的细胞毒性。2.5黄酮类黄酮类化合物广泛存在于植物界，其生物活性多种多样，近年来其防癌与抗癌活性成为人们研究的热点，含有黄酮结构的端粒酶抑制剂也陆续被报道。四羟基黄酮类化合物35端粒酶抑制活性的L50值为0.2μmol·L-1，Menichincheri等人对其进行结构改造设计合成了一系列衍生物36～39，L50值依次为0.82、0.6、0.80、0.13μmol·L-1，其中，化合物39的活性优于先导化合物35。将C环邻羟基用取代的咪唑环替换，并将B环羟基用甲氧基替换得到化合物40，其活性与先导化合物相当，L50值为0.47μmol·L-1，而其结构与先导物35相比有较大改变，可以作为新的结构类型进行更深入的研究。Liu等人报道了一系列新型的含黄酮结构的2-氯吡啶衍生物41～45，并对所有化合物进行了细胞毒活性、Taq聚合酶以及端粒酶活性评价，结果显示，化合物44、45对细胞株SGC-7901的细胞毒活性［L50值分别为(22.28±6.26)mg·L-1和(18.45±2.79)mg·L-1］优于阳性对照药5-氟尿嘧啶［L50值为(7.38±0.98)mg·L-1］，化合物41～45均具有一定的端粒酶抑制活性，其中，化合物44的活性最正确，L50值为(0.8±0.07)μmol·L-1。构效关系研究说明:黄酮母核2位或7位羟基被2-氯吡啶苄基取代时活性增强(44、45)，5位为羟基时活性显著提高(44)，因此推测5位羟基可能为此类化合物活性的必需基团。为了研究此类化合物的作用机制，Liu等人又以活性最好的化合物44与端粒酶活性靶点(PDB3DU6)进行分子模拟对接，对接示意图及结合模式见图1，对接结果显示:化合物44的1位氧、4位羰基和5位羟基、7位醚键氧原子、C环嘧啶上氮原子分别与Gln308、Arg194、Asp254、Gly314等氨基酸残基形成4个氢键，2-氯吡啶环插入到由Lys189、Asn369、Ile252、Arg253组成的疏水口袋内，对化合物的活性有着很重要的影响。除上述黄酮类化合物之外，一些黄酮类似物也被陆续报道具有抑制端粒酶活性。Rao等人检测了14个合成或者天然的化合物在人类肺腺癌A549株中对端粒酶的抑制活性。结果发现，黄酮衍生物46(HTMC)具有强的端粒酶抑制活性，在50μmol·L-1HTMC作用下，24h后肺癌细胞A549细胞增殖降低59%，HTMC还能降低人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达。进一步研究发现，HTMC对端粒酶以及人端粒酶逆转录酶活性的抑制是通过释放Ca2+离子来实现的。Seimiya等人报道的表没食子儿茶素没食子酸酯类似物47(MST-199)也是一个黄酮衍生物，其端粒酶抑制活性的L50值达0.38μmol·L-1，这些化合物的发现为黄酮类抗癌药物的研究提供了新的方向。2.6吖啶类安吖啶是第一个吖啶类抗癌药，由Cain等人于1974年首次合成，其抗癌作用机制类似于蒽醌类，它与腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对有相互作用，从而阻止DNA作为DNA复制和RNA合成的模板。近年来陆续有文献报道吖啶类端粒酶抑制剂，Gowan等人报道了3，6，9-三取代的吖啶类端粒酶抑制剂BRACO19(48)，这个化合物是当时发现的最具潜力的无细胞体系端粒酶抑制剂，L50值为(115±18)nmol·L-1，而且不会引起急性细胞毒性。Harrison等人合成了一些BRACO19的类似物，通过改变取代基的位置，得到2，6，9-、2，7，9-、3，6，9-三取代的吖啶类衍生物(49)，活性研究结果证实，这些化合物均具有端粒酶抑制活性，其中，3，6，9-三取代物活性最强，其他方式的取代其活性都有不同程度的降低。Heald等人报道了一组吖啶盐类化合物50～55，在端粒重复扩增分析(TRAP)法评价中，这些化合物都显示出良好的端粒酶抑制活性，化合物52、53的活性尤为突出，构效关系研究说明:N上甲基取代优于乙基，小分子基团有利于活性的提高;阴离子决定化合物的水溶性，阴离子为I-时水溶性较MeOSO-3差;当R由甲基变为F取代时，对四链体等结构选择性增强，如与化合物52(RHPS3)相比，53(RHPS4)对三链体和四链体DNA等结构有较好的选择性，而且溶于水，在pH值5.0～9.0的条件下保持稳定，能有效地导入到肿瘤细胞中，已成为此类端粒酶抑制剂的先导化合物，有待于更深一步的研究。2.7噻唑酮类Hayakawa等人对包含16000个合成化合物库进行了筛选，筛选出4个强端粒酶抑制活性的噻唑酮类化合物56～59，构效关系研究说明:芳环上引入吸电子基团有利于活性提高，取代基的位置与类型也对化合物活性有一定的影响，间位取代优于对位取代，如化合物56(TMPI)抑制端粒酶的活性最强(TRAP评价法)，L50值达1μmol·L-1，优于化合物58、59，其对真核生物DNA聚合酶α、β以及人艾滋病病毒逆转录酶(HIVRT)等无抑制作用，因此对端粒酶具有高选择性。研究显示，用1mmol·L-1的二硫苏糖醇或者谷胱甘肽能抑制TMPI的作用，这种抑制可能作用于半胱氨残基，TMPI对端粒酶的作用有助于寻找新型抗肿瘤药物。2.8其他类Kakiuchi等人研究发现了一个1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物60(TELIN)，在无细胞体系TRAP评价中发现，TELIN是一个强端粒酶抑制剂，端粒酶抑制活性的L50值为0.3μmol·L-1。动力学试验显示，TELIN不是与DNA蛋白结合而是与端粒酶蛋白结合，是竞争性与非竞争性混合型端粒酶抑制剂。Yin等人研究发现了一个小的线型分子三亚乙基四胺(61，TETA)，它具有较强的端粒酶抑制作用(L50=7.8μmol·L-1)，且其急性毒性较低，TE