资料二分子生物学工具酶课件

分子生物学工具酶中晶生物

工具酶是一类用于DNA重组过程中不同DNA分子的制备、切割、修饰、扩增,核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。概述分类：限制性内切酶连接酶逆转录酶DNA、RNA聚合酶其它酶类

大多数来自不同的微生物和噬菌体少数酶来自动物和动物病毒另一些工具酶编码的基因也被克隆出来,并用大肠杆菌细胞来生产这些工具酶。一、限制性内切酶5'-G^AATTC-3'3'-CTTAA^G-5'EcoRI#ER02715000u#ER0272

5x5000u#ER0273

H,25000u市场容量：1.5亿美金其命名以该酶来源的原核生物的名称为依据。第一个大写字母：取自于属名的第一个字母第二、三个小写字母：取自于种名的前两个字母字母后面罗马字：该种生物中不同限制酶分离先后顺序限制酶名称的前三个字母常用斜体或加下横线表示限制酶的命名分离纯化：几千种限制性内切酶商品化：200多种限制性内切酶限制酶的种类限制性内切酶兰白反应推荐缓冲液作用最适温度作用产物连接效率星号活性GC甲基化末端失活高浓度GenomeQualified限制性内切酶说明书LabeledOligonucleotide(LO)test

A–Invitrogen B–RocheC–NEB

D–StratageneE–Promega

F–Fermentas

不同供应商RELO检测分析-purecontaminatedminorcontaminationX*19962001通过LO检测的REs(%)RocheInvitrogenNEBStratagenePromegaFermentasPureExtreme™

限制性内切酶优势所有Fermentas内切酶都达到PureExtreme™（致纯）–最高品质保证产品投诉少严格的批间一致性保证产品质量稳定性几乎所以的酶都采用标准浓度–10units/µl实时质量监督所有FermentasRE在优化Buffer中有100%活性Easy-to-useFiveBufferPlusSystem每个FermentasRE含两种buffer：-

颜色区分，优化buffer： blue(B+) green(G+) orange(O+) red(R+) yellow(Y+/Tango™)和-

UniversalY+/Tango™DoubleDigestbuffer浓度优化的BSA预先加入所有RE缓冲液中改进的REsearchengine/research/appDoubleDigestion，双酶切/doubledigest/index.htmlDoubleDigest–提供DD最佳反应条件/doubledigest/double.phpFermentasRE畅销排行榜（Top20）

BamHI

BcuI(SpeI)BglII

EcoRI

Eco47III

Eco57I

HindIII

MboI

MnlI

NotI

NcoI

NdeI

NheI

PaeI(SphI)

SacI

SalI

TaiI(MaeII)

Tru1I(MseI)

XbaI

XhoI补充：PstI与竞争对手的比较LO测试–达到PureExtreme™:无其它活性的污染种类第二多ISO9002认证和质量控制

FiveBufferPlusSystem，加有BSAY+/Tango™，通用双酶切buffer列出有效期,通过实时监控保证100％活性价格优势未经LO测试,但有很多重组内切酶种类第一多无认证，质量控制未核实单独提供BSA无双酶切用buffer仅有出厂化验日期,距客户购买日期可能会有一年之久价格相当FermentasvsNEB与竞争对手的比较LO测试–达到PureExtreme™:无其它活性的污染种类第二多ISO9002认证和质量控制

FiveBufferPlusSystem，加有BSAY+/Tango™，通用双酶切buffer列出有效期,实时监控保证100％活性价格优势未经LO测试,种类较少，约100种有认证，质量控制不严Buffer中加有BSA无双酶切用buffer列出有效期价格相当FermentasvsTakara与竞争对手的比较LO测试–达到PureExtreme™:无其它活性的污染内切酶种类第二多ISO9002认证和质量控制列出有效期,通过实时监控保证100％活性FiveBufferPlusSystem，加有BSAY+/Tango™，通用双酶切buffer专注于内切酶方面价格优势未经LO测试内切酶种类少有认证11种buffers及Multi-Core™4,不提供BSA未提供双酶切的详细信息非主要产品线大幅度折扣FermentasvsPromega与竞争对手的比较LO测试–达到PureExtreme™:无其它活性的污染内切酶种类第二多ISO9002认证和质量控制FiveBufferPlusSystem，加有BSAY+/Tango™，通用双酶切buffer价格优势未经LO测试有认证非主要产品线9种buffers,不提供BSA

未提供双酶切的详细信息大幅度折扣FermentasvsInvitrogenFastDigest™RestrictionEnzymesNEW!FastDigest™限制性内切酶FastDigest™–5mindigestion1µl

ofenzyme37oCtemperatureONEbufferForALLFastDigest™enzymes超过70多种FastDigest酶数量快速增长产品特点独特的产品线酶切质粒DNA只需5minat37°C特殊的形式：1µlenzyme无需换算酶切单位通用Buffer，针对所有的酶切实验

一种温度：37°C反应~200ng纯化的质粒DNA(5min酶切)适合单酶切、双酶切和三酶切反应操作简单：无需考虑酶量、Buffer、温度和星活性客户定位基因的体外突变等诸方面

限制性内切酶的应用各种DNA分子的体外重组限制酶谱的绘制基因的亚克隆分析基因和染色体结构的分析限制性内切酶使用常见问题分析（一）Q1、DNA完全没有被内切酶切割内切酶失活：标准底物检测酶活性DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA条件不适（试剂、温度）：检查反应系统是否最佳DNA酶切位点上的碱基被甲基化：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株DNA酶切位点上没有甲基化（如DpnI）：换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3AI代替DpnI)，重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增DNA位点上存在其它修饰：将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证DNA不存在该酶识别顺序：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证限制性内切酶使用常见问题分析（二）Q2、DNA切割不完全内切酶活性下降：用5-10倍量过量消化内切酶稀释不正确：用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶DNA不纯，反应条件不佳：同上内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰：同上部分DNA溶液粘在管壁上：反应前离心数秒内切酶溶液粘度大，取样不准：将内切酶稀释，增大取样体积酶切后DNA粘末端退火：电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性：使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡过度稀释使酶活性降低：适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏反应条件不适：使用最佳反应体系识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序：加大酶量5-10倍限制性内切酶使用常见问题分析（三）Q3、内切酶保存期内快速失活保存温度不当：贮藏在含50%甘油的贮藏液中，-20℃低温保存以稀释形式保存：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用贮藏缓冲液不适当：使用厂家推荐的贮藏缓冲液低蛋白浓度：内切酶与500ug/ml的BSA一起保存Q4、酶切后的DNA片段连接效率低含磷酸盐的浓度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸盐内切酶失活不全或含有ATP酶：内切酶失活不全或含有ATP酶平末端连接：加大T4DNALigase用量外切酶污染：减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA连接缓冲液不合适：重新配制连接缓冲液限制性内切酶使用常见问题分析（四）Q6、电泳后DNA片段的带型弥散，不均一DNA上结合有蛋白质：电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化内切酶中含有DNA外切酶：减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶Q5、DNA片段数目多于理伦值内切酶星状活性：检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量其它内切酶污染：用λDNA作底物检查酶切结果底物中含其它DNA杂质：电泳检查DNA，纯化DNA片段Q7、酶切后没有观察到DNA片段的存在DNA定量错误（如RNA含量较高）：用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量在酶切反应液中形成非特异的沉淀：在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次DNA/RNA修饰酶T4DNALigase(LOtested)KlenowfragmentT4PolynucleotideKinaseT4DNAPolymeraseRevertAid™M-MuLVReversetranscriptases(LOtested)TerminalDeoxynucleotidylTransferase(LOtested)RibonucleaseInhibitorRibonucleasesCalfIntestineAlkalinePhosphataseShrimpAlkalinePhosphataseProteinaseKFermentas畅销修饰酶T4DNALigase–LOtested单位：Fermentas–国际Weissunit(ATP-PPexchange)NEB–粘端连接单位1Weiss单位＝200粘端连接单位

相关产品：RapidDNALigationKitRapidDNALigation&TransformationKitReversetranscriptasesAMV：

从禽类成骨髓细胞瘤病毒中分离，有RNaseH活性，42℃时比M-MuLV稳定，最高逆转录温度高达72度（Finnzymes）。增加逆转录的特异性，适合具有二级结构的模板RT

RevertAidM-MuLV(LOTest)：

从莫洛尼鼠白血病毒中分离，有RNaseH活性。42度逆转录，最长可获得13kb的cDNA。M-MuLV(RNaseH-)(LOTest)：从莫洛尼鼠白血病毒中分离，消除了RNaseH活性，适合合成全长的cDNA。42度逆转录，最长可获得13kb的cDNA，产量比含有RNaseH活性的酶要高很多。RibonucleaseInhibitors（RNA酶抑制剂）

概述非共价1:1结合RNase，抑制RNases-A,B,C活性。对BacterialRNases–H,T1,1,S1,U1,U2,CL3无效LOTest：超纯，无其它酶蛋白污染作用温度范围：25-55度，最佳反应稳定37度适用PH值范围5.0-9.0应用：RNA分离与纯化体外转录，保证RNA转录本的完整性cDNA合成：保护模板RNA、增加cDNA产率、增加全长cDNA比例RT-PCR：保护模板RNA，增加RT-PCR产率

碱性磷酸酶（AP)应用:除去载体和插入片段5’-磷酸基团，预防载体或插