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文档简介

干扰素效价测定（细胞病变抑制法）干扰素效价测定（细胞病变抑制法）北京广源恒信科技发展有限公司1试验材料所用试剂均需分析纯或与指定产品相当。1.1MEM培养液按说明书配制，经除菌过滤，置于玻璃或塑料瓶中，4C保存。使用期限不得超过产品标示有效期。1.2牛血清应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中牛血清的有关要求。1.3完全培养液MEM培养液添加10%牛血清。1.4测定培养液MEM培养液添加7%牛血清。1.5攻毒培养液MEM培养液添加3%牛血清。1.6消化液取0.2g乙二胺四乙酸二钠、8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.152g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾，用蒸馏水配成1000ml的溶液，经121C、15分钟高压灭菌。1.7染色液取50mg结晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml。1.8脱色液50%乙醇，50%蒸馏水，0.1%乙酸（ml/ml）。1.9标准品干扰素效价测定用国家标准品。PBS取8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾用蒸馏水配成1000ml的溶液，经12UC、15分钟高压灭菌。WISH细胞（人羊膜细胞）WISH细胞在培养基中呈单层，贴壁生长，每周2次，1：4消化传代，于完全培养基中生长。VSV（水泡性口炎病毒）-70C保存。2试验步骤2.1〜2.7项各步骤应于无菌条件下进行。2.1铺板弃去WISH细胞培养瓶中的培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配成2.5x105〜3.5x105个细胞/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100plo37C,5%CO2条件下培养4〜6小时。2.2制备标准溶液取1支标准品按说明书溶解后，用测定培养液稀释至103IU/mlo2.3制备样品溶液将待检样品按说明书溶解后，用测定培养液稀释至103IU/mlo2.4于96孑L细胞培养板中每孔加入1505测定培养液。在A6、A7各孔中每孔加入50pl标准溶液，在A2、A3;A4、A5;A8、A9;A10、A11各孔中每孔加入505各待检样品溶液，每个待检样品做2个复孔。自A行取505至H行作4倍稀释，每孔留1505余液。2.5加样取2.1项制备的细胞培养板。将2.4项制备的溶液移入该细胞培养板，每孔100plo37C,5%CO2条件下培养18〜24小时。2.6制备病毒液攻毒剂量为100TCID50，取保存的VSV用攻毒培养液稀释至工作浓度。2.7攻毒取2.5项制备的细胞培养板，弃去上清。加入病毒液，每孔1005。37C,5%CO2培养24小时（镜检标准溶液的50%病变在D或E行）。2.8染色弃去上清，每孔加入50口1染色液，室温方攵置30分钟。2.9脱色流水小心冲去染色液，吸干残留水分。每孔加入1005脱色液，室温放置3〜5分钟。2.10比色测定波长570nm，参比波长630nm，记录测定结果。3结果计算采用计算机程序或直线回归计算法进行处理。分别计算各试验样品的半效稀释倍数（即从样品溶液至相当于标准品50%最大效应点的

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