第三章 细胞生物学研究方法

细胞生物学

CellBiology伊犁师范学院编辑课件

课程内容第一章绪论第二章细胞根本知识概要第三章 细胞生物学研究方法第四章细胞质膜与细胞外表第五章 细胞质基质与内膜系统第六章细胞的能量转换第七章细胞核与染色体第八章 细胞增殖及其调控第九章核糖体第十章细胞骨架第十一章细胞分化与基因表达调控第十二章细胞衰老与凋亡编辑课件第三章细胞生物学研究方法伊犁师范学院生物与园林教研室何春霞制作编辑课件

细胞形态结构的观察方法

细胞组分的分析方法

细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞生物学CellBio编辑课件第一节细胞形态结构的观察方法显微镜和显微镜的分辨能力肉眼：0.2mm;光镜：0.2um;电镜：0.2nm编辑课件Microscopytechnologies

Lightmicroscopy(1600’s)

Brightfield

Phasecontrast

Nomarski

Electronmicroscopy(1930’s)

ScanningEM

TransmissionEM

Fluorescencemicroscopy(1911)

Fluorescence

Deconvolution Confocal

01_06_Whatcanwesee.jpgSizerangeoftypicalcells?Typicalmolecule?编辑课件01_09_Scale.jpg编辑课件01_07_Internalstructures.jpgInternalstructuresofcellcanbeseenwithlightmicroscope编辑课件一、光学显微镜技术二、电了显微镜技术三、扫描隧道显微镜(STM)编辑课件普通复式光学显微镜〔lightmicroscope〕荧光显微镜〔fluorescencemicroscope〕激光共聚焦显微镜〔laserscanningconfocalmicroscope〕相差显微镜〔phase-contrastmicroscope〕〔光程差或相位差转变为振幅差，相差板〕微分干预显微镜〔differential-interferencemicroscope〕一、光学显微镜技术编辑课件1、普通复式光学显微镜技术普通光学显微镜〔最大分辨率为0.2µm〕，主要由三局部组成：①光学放大系统，即目镜和物镜；②照明系统；③机械和支架系统。

编辑课件编辑课件D=0·61λN·sinɑ/2λ:光源波长;α:物镜镜口角;N:介质折射率显微镜的性能优劣决定于它的分辨率。分辨率是指显微镜区分开相近两点的能力。

编辑课件Stainedtissuesectionshowingurine-collectingDuctsinthekidneyStainedwithhematoxylinandeosinDuctcomposedofcloselypackedcellsNucleistainedredExtracellularmatrixstainedblue编辑课件2、荧光显微镜技术FluorescenceMicroscopy

在紫外光显微镜根底上开展而来，利用样品自发荧光和诱发荧光，可以对某些生物大分子进行定性和定位研究。不仅可以观察固定切片标本，还可以在活体染色后对活细胞进行研究。

编辑课件荧光显微镜及其照片微管呈绿色、微丝红色、核蓝色编辑课件FluorescentImageofaCellinMitosisSpindlemicrotubulesrevealedwithagreenfluorescentantibody

Centromeres–redfluorescentantibodyDNA–bluefluorescentdye编辑课件

激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点。共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态以及亚细胞形态和组分。3、激光共焦点扫描显微镜技术

laserconfocalscanningmicroscope编辑课件激光共聚焦原理编辑课件激光共聚焦扫描显微镜编辑课件LCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)编辑课件Amitoticfertilizedeggfromseaurchin

编辑课件4、相差显微镜技术Phase-contrastmicroscopy相差显微镜由P．Zernike于1932年创造，并因此获1953年诺贝尔物理奖。特点：样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。

编辑课件编辑课件Brightfieldandphasecontrast编辑课件5微分干预显微镜技术Differentialinterferencemicroscopy(DIC)微分干预显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞中较大的细胞器。

编辑课件编辑课件〔一〕电了显微镜根本知识

分辨率最终决定于光的波长，由于使用电子束作光源，电镜的分辨率大大提高。电镜的分辨率常常是超薄切片厚度的1/10，它的分辨率可达0.2nm，其放大倍数为106倍。

二、电了显微镜技术编辑课件电镜的根本构造包括：

①电子束照明系统；②电磁透镜成像系统；③真空系统；④记录系统；⑤电源系统。编辑课件

光学显微镜电子显微镜发光源灯泡电子枪光源可见光、紫外光电子束透镜玻璃透镜电磁透镜真空系统空气真空成象色彩彩色单色标本制作石蜡、冰冻切片超薄切片光镜显微镜与电子显微镜的比较编辑课件编辑课件

〔二〕主要电镜制样技术介绍

主要的用于观察生物样品的电镜技术有：①超薄切片技术；是观察细胞超微结构的根底。②负染色技术；③冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术技术；④电镜三维重构技术；⑤扫描电镜技术〔SEM〕；是观察细胞外表形貌的有力工具。编辑课件

样品制备技术的特殊要求：①样品要薄；②更好地保持样品的精细结构；③样品具有一定的反差。编辑课件1.超薄切片

通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差编辑课件切片流程图超薄切片技术编辑课件超薄切片机编辑课件Electronmicrographofacellinaroottip编辑课件Transmissionelectronmicrographofalivercellincrosssection编辑课件2.负染技术负染就是用重金属盐〔如磷钨酸、醋酸双氧铀〕对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品枯燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方那么没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。编辑课件3.冰冻蚀刻〔freeze-etching〕

冰冻蚀刻亦称冰冻断裂〔freeze-fracture〕。标本置于-100°C的干冰或-196°C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻〔etching〕。

编辑课件蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构编辑课件编辑课件4.扫描电子显微镜〔scanningelectronmicroscope，SEM〕扫描电子显微镜于20世纪60年代问世，用来观察标本的外表结构。原理：次级电子光信号电信号显示出与电子束同步的扫描图像。作用：主要用于观察样品外表的形貌特征。编辑课件编辑课件是一种探测微观世界物质外表形貌的仪器，在纳米生物学的研究领域具有独特的优越性。STM的特点：①具有原子尺度的高分辨本领；②可在真空、大气、液体等条件下工作；③非破坏性测量。三、扫描隧道显微镜(STM)编辑课件透射电子显微镜JEM-1011透射电子显微镜编辑课件透射电镜编辑课件第二节细胞组分的分析方法一、高速、超速和梯度密度离心别离各种细胞器、生物大分子及其复合物利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。差速离心与密度梯度离心相结合可以到达精确的别离。编辑课件差速离心编辑课件编辑课件

各种生物大分子蔗糖中的密度

名称密度g/cm3

质膜1.06-1.10光滑的内质膜网1.06高尔基器、高尔基体1.16完整致癌病毒1.16-1.18线粒体1.19溶酶体1.21过氧化物的酶体1.23植物病毒1.30-1.45可溶性蛋白1.30肠道病毒1.30-1.45核蛋白、核酸、核糖体1.60-1.75糖原1.70

编辑课件二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类的显色DNA：福尔根〔Feulgen〕反响－－紫红色Schiff试剂是由碱性品红和亚硫酸钠配制而成。可以和醛基反响形成紫红色的溶液。在生物实验可以和经过酸化的DNA发生反响，DNA被染成紫红色，而不和核仁，细胞质发生反响，因此可以来鉴定DNA的存在。编辑课件多糖类：PAS反响－－红色过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖中乙二醇基〔CHOH-CHOH〕氧化成二个游离醛基〔—CHO〕，游离醛基与Schiff试剂反响生成紫红色产物，颜色深浅与多糖含量成正比。编辑课件脂肪：苏丹III－－红色编辑课件蛋白质：米伦〔Millon〕反响－－红色蛋白质溶液中参加米伦试剂〔亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液〕，蛋白质首先沉淀，加热那么变为红色沉淀，此反响为酪氨酸的酚核所特有的反响，因此含有酪氨酸的蛋白质均呈米伦反响。还有哪些显色方法？编辑课件

免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。1、免疫荧光技术

免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术相结合研究特异蛋白质抗原在细胞内分布的方法。三、特异蛋白质抗原的定位与定性编辑课件2、免疫电镜技术

免疫电镜技术使特异蛋白的定位与超微结构结合起来，使抗原定位更准确。如蛋白分泌的研究胞内酶的研究；一些结构蛋白的研究。免疫电镜技术可分为免疫铁蛋白技术，免疫酶标技术，免疫胶体金技术。编辑课件胶体金

是由氯金酸在复原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。

胶体金在弱碱环境种带负电荷，可与蛋白质的正电荷结合，不影响蛋白质的性质。编辑课件1、原位杂交技术用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。2、Southern技术〔了解〕蛋白样品经电泳后，与DNA探针进行吸附，与DNA有亲合作用的蛋白带被显示出来。3、PCR技术四、细胞内特异核酸的定位与定性编辑课件原位杂交技术编辑课件