DB37-T 3533-2019 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法

65.020.01B

40

DB37

37/T

3533—2019驴骡马皮张源性成分鉴定实时荧光定性

PCR

法

of

mule/hinny

and

horse

leather

fluorescent

PCR

发布

实施山东省市场监督管理局发

布DB37/T

3533—2019前言

................................................................................

II1

范围

...............................................................................

12

规范性引用文件

.....................................................................

13

术语和定义

.........................................................................

14

原理

...............................................................................

15

试剂或材料

.........................................................................

15.1

试剂

...........................................................................

15.2

材料

...........................................................................

25.3

配制溶液

.......................................................................

26

仪器设备

...........................................................................

37

检测用引物和探针

...................................................................

38

试验步骤

...........................................................................

38.1

样本制备

.......................................................................

38.2

提取........................................................................

38.3

实时荧光

反应

...............................................................

39

试验数据处理

.......................................................................

49.1

有效性判定..................................................................

49.2

检测结果分析和表述

.............................................................

410

检测过程中防止交叉污染的措施

......................................................

4附

录 A

（规范性附录）

实时荧光定性

引物/探针序列、反应体系和结果判定

...........

5附

录 B

（资料性附录）

目的基因扩增靶标参考序列

....................................

7DB37/T

3533—2019 本标准按照GB/T

给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。宏济堂制药集团股份有限公司、济南张景牧业科技发展有限公司。郝大魁、张同清、谭晴晴、步迅、陈淑娟。IIDB37/T

3533—2019

PCR

1 范围本标准规定了驴、骡和马3种动物皮张源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。本标准适用于动物皮张及初加工品中驴、骡和马3种源性成分的定性检测。本方法检出限为0.5

%。2 规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T

27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光real-time

fluorescence

在PCR定量分析。3.2Ct值 cycle

threshold每个实时荧光反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 原理根据核基因CKM(creatine

kinase

为靶基因设计马属动物通用引物以及驴和马特异性探TaqMan实时荧光PCR马和骡3种动物源性成分。5 试剂或材料除另有规定外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T

6682规定的一级水。5.1试剂5.2.2 2×TaqManMaster

5.2.2 2×TaqManMaster

Taq

DNA

1

U/20

µLMg

（终浓度

2.0

mmol/µL5.1.1

氯化钠（NaCl）。5.1.2

浓盐酸（）。5.1.3

三羟甲基氨基甲烷（Tris

base）。5.1.4

二水乙二胺四乙酸二钠（2EDTA·2H2O）。5.1.5

十二烷基硫酸钠（）。5.1.6

蛋白酶冻干品。5.1.7

异硫氰酸胍（GuSCN）。5.1.8

硅珠。5.1.9

无水乙醇。5.2 材料5.2.1 驴、骡和马

3

种动物皮张源性成分实时荧光

定性检测试剂盒。2+dNTPs（终浓度

0.2

mmol/µL）。5.3 配制溶液5.3.1 1

mol/L

）溶液：称取

12.1

g

三羟甲基氨基甲烷置于

烧杯中，加入80

mL

至

8.0，转移至

100

容量瓶中,加水定容至刻度，

KPa

蒸汽压（121

℃）灭菌

，室温保存待用。5.3.2 1

mol/L

Tris-HCl

）溶液：称取

12.1

g

置于

100

mL

烧杯中，加入

80

mL

水，用浓盐酸调节

pH

至

，转移至

容量瓶中,加水定容至刻度，103.4

蒸汽压（121

℃）灭菌20

min，室温保存待用。5.3.3 0.5

mol/L

EDTA（pH

8.0）溶液：称取

18.61

g

二水乙二胺四乙酸二钠置于

100

烧杯中，加入

80

10

%

pH

至

100

mL

103.4KPa

蒸气压（

℃）灭菌

20

min，室温保存待用。5.3.4 10

%

10

g

十二烷基硫酸钠溶解于

mL

无菌水中，转移至

容量瓶中，加水定容至刻度。储存于灭菌过的容器中待用。5.3.5 5

mol/L

氯化钠溶液：称取

29.22

g

氯化钠溶解于

80

mL

无菌水中，转移至

mL

容量瓶中，加水定容至刻度，103.4

蒸汽压（121

20

min，室温保存待用。5.3.6细胞裂解液（Lysis

）：取

1

mol/L

（pH

8.0）20

mL，0.5

mol/L

二水乙二胺四乙酸二钠（pH

）5

mL，

mol/L

氯化钠

mL，10

%十二烷基硫酸钠

5

，转移至

100

mL容量瓶中，加水定容至刻度。5.3.7 20

mg/mL

蛋白酶

K

溶液：称取

g

蛋白酶冻干品，加水溶解，转移至

10

容量瓶中，加水定容至刻度，分装后于

℃保存。5.3.8 RNA

酶溶液：称取

1

g

冻干品

酶

A

6

无菌水中，于

℃加热

15

min，缓慢冷却至室温，转移至

mL

容量瓶中，加水定容至刻度，分装成小份存于-20

℃。5.3.9 DNA

结合液：称取

60

g

异硫氰酸胍，加入

5

mL

1mol/L

（pH

6.4）溶液，再加入

8

0.5

mol/L

乙二胺四乙酸二钠（pH

），然后再加入

4

mL

Trition

X-100

溶液（温度

60

℃），转移至

容量瓶中，加水定容至刻度。5.3.10 漂洗液：称取

g

异硫氰酸胍，加入

5

mL

1

mol/L

Tris-HCl（

6.4）溶液，再加入

8

mL

mol/L

EDTA（pH

8.0），转移至

100

mL

容量瓶中，加水定容至刻度。DB37/T

3533—20195.3.11 TE

缓冲液：量取

0.5

mL

mmol/L

Tris-HCl（pH

）、0.1

mL

mol/L

乙二胺四乙酸pH

8.0

pH

至

8.0

mL

103.4

蒸汽压（

℃）灭菌

min，降至室温，4

℃保存备用。6仪器设备6.1

实时荧光定量

仪：4

通道以上。6.2

电子分析天平：感量

0.1

mg

或

0.01

g。6.3

离心机：最大离心力不小于

13

000

g。6.4

振荡型恒温金属浴：0

℃～100

℃。6.5

高压灭菌锅。6.6

低温冰箱：-20

℃～4

℃

。6.7

超净工作台。6.8

微量移液器：

µL～1

µL，

µL～

µL，2

µL～20

µL，

µL～

µL。6.9

容量瓶：10

mL，50

mL，

mL。7 检测用引物和探针内标质控引物探针序列和马属动物通用PCR引物、驴和马的特异性探针序列见附录A中表A.1，引物探针在序列中的位置参见附录B。8 试验步骤8.1 样本制备盐干皮或鞣制皮张在平整处边缘取约5

g，去除毛、脂肪，将试样在无菌水中浸泡20

min，用无菌水清洗2次，剪成直径约5

mm左右小块，使用液氮充分研磨成粉末。8.2 DNA

提取8.2.1 称取试样

mg±5

mg

于

2

mL

的离心管中，每个样品设立

2

400

µL

的

DNA

提取细胞裂解液、10

µL

蛋白酶

K

混匀，56

℃水浴

2

h，期间轻微混匀

3～5

次。8.2.2 于

12

g

离心

5

，吸取上清液转至新的

1.5

mL

离心管中，加入硅珠悬浮液

µL、DNA结合液

800

µL，充分混匀室温静置

5

min，8

000

g

离心

1

min，弃上清液。8.2.3 加入

µL

漂洗液，涡旋振荡悬浮

s，8

g

离心

1

，弃上清液。加入

700

µL

的

%乙醇洗涤，8

g

离心

1

min

弃上清液，重复此步骤

2

次。8.2.4 于

8

g

离心

30

s，吸走残余液体，室温干燥

min，至残余乙醇挥发干。8.2.5 加入

µL

TE

缓冲液溶解

DNA，加入

1

µL

RNA

酶溶液，55

℃水浴

5

min，8

000

g，离心

1

min，吸取上清液转移至新的离心管中，

℃保存备用。8.2.6 紫外分光光度计检测提取的

DNA

浓度与纯度，测定

260

和

280

nm

处吸光值

A260280，比值在1.7～

之间，DNA

浓度约为

µL～

µL。8.2.7 也可采用经验证等效的动物组织

DNA

提取试剂盒，按照使用说明书提取。8.3 实时荧光

反应DB37/T

3533—20198.3.1 试样实时荧光

检测多重实时荧光，PCR反应体系中包括驴和马2种动物源性的特异探针，并加入内标质控体系。A中表A.2。8.3.2 对照实时荧光

反应体系每个反应设置3次平行。在试样反应的同时，设置空白对照、阴性对照和阳性对照：a)

空白对照：以水作为空白对照；b)

阴性对照：以

3

种动物之外的动物基因组

DNA

为阴性对照；c)

阳性对照：将驴、马和骡

3

种动物基因组

DNA

等量混匀作为阳性对照。8.3.3实时荧光

反应体系配制按照附录A中表PCRPCR，3

000

g离心1

，取出管，放入荧光定量PCR仪中。8.3.4实时荧光

反应程序95

℃预变性3

；95

℃

变性

s，62

℃退火延伸35

s，40个循环。9 试验数据处理9.1 PCR

有效性判定空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明PCR体系有效：a)

和

JOE

值＞40.0

值≤35.0；b)

FAM

和

荧光的

S

值＞40.0

质控探针的荧光信号，且

Ct

值≤35.0；c)

阳性对照：有

、JOE

和

CY5

荧光的

S

型扩增曲线，且

Ct

值≤35.0。否则判定为PCR无效。9.2 检测结果分析和表述9.2.1 在

PCR

反应体系有效的情况下，当有

FAM、

荧光扩增曲线出现，若

值≤35.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分；若无典型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。9.2.2 在

PCR

反应体系有效的情况下，当有

FAM、

荧光扩增曲线出现，但

35.0＜Ct

值＜40.0，则需要重新提取

进行

反应。若再次扩增后的

值＜40.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分；若再次扩增后无典型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。9.2.3 对样品检测结果的判定，见附录

A

中表

。10 检测过程中防止交叉污染的措施防治污染的措施按GB/T

规定执行。5'-3'bpCKMFTCATCGTAGCATCGAGGGG228CKMRAGCAGAGCAGGAAGGGAGTTIMFAGACCACCAAATGCCCCTATC140IMRCGAGATTGAGATCTTCTGCGACIMP5’CY5-GCGAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGC-3’DABLv-P5’JOE-ATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGCCT-3’BHQ2M-P5’FAM-ATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCT-3’DABAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGCKMF/CKMR加量（μL）2×TaqManMaster

101×10×

Primer

CKMF/R0.50

µmol/LIMF/IMR0.10

µmol/L10×

Lv-P0.10M-P0.20

µmol/LIMP0.10

µmol/L-310

1.0

ngddH2

20DB37/T

3533—2019AA附

录 A（规范性附录）实时荧光定性

引物/探针序列、反应体系和结果判定A.1 实时荧光定性引物和探针序列实时荧光定性引物和探针序列见表A.1。表A.1 实时荧光定性

表A.1 实时荧光定性

引物和探针序列实时荧光定性引物和探针序列见表A.2。表A.2 多重实时荧光表A.2 多重实时荧光

反应体系对各种样品检测结果的判定见表A.3。

CtCt

DB37/T

3533—2019表A.3表A.3实时荧光

定性检测方法各种实验结果的判定DB37/T

3533—2019BB附

录 B（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列B.1 马(Equus

caballus)

PCR产物序列（Genbank:JQ065978.1）马(Equus

caballus)

PCR产物序列

（Genbank:JQ065978.1）TTCCCGAATTCGCCTGCGACTCATCGTAGCATCGAGGGGAGAGGCTCTCTCTTTCCCGGCCTCTCTCTCCCCATCTCGGAAACAACCGGATCTTTCAAGTCTCTGC