草本刺嫩芽多糖的提取纯化及其性质研究

沈阳农业大学硕士学位论文草本刺嫩芽多糖的提取纯化及其性质研究姓名：王悦申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：李秉超20070601独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何奉献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：ｊＬ，恢Ｊ时间：．２０’ｏ’７年６日ｆ踮导师签名：耖荔也ａｄ’一时间：２∞７辱ｆ其ｌｇｉ３关于论文使用授权的说明本人完全了解沈阳农业大学有关保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保存送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。〔保密的学位论文在解密后应遵守此协议〕研究生签名：三，Ｉ刺时间：山口７年／月／８日导师签名：鸯氢也时间：２即７年厂月／ｇ日沈阳农业大学硕士学位论文草本剌嫩芽多糖的提取纯化及其性质研究摘要研究生：王悦导师：李秉超草本刺嫩芽〔Ａｒａｌｉａｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌｉｓ．ｋｉｔａｇ〕为五加科多年生草本植物，学名：长白搀木，又名东北土当归、土当归、舌秸颗、狗苦龙芽、牛尾大活等，其嫩芽是著名的营养丰富的名贵珍稀食用山野菜，野生草本刺嫩芽多生于针阔混交林、杂木林、山坡灌丛问。草本刺嫩芽的根、叶、花含挥发油，其中根含２９６，叶含０．５８％：叶和茎含有黄酮、香豆素，根、茎含有皂甙：茎皮含有单宁：根还含有淀粉１９．４％，可溶糖１．６９％等：果实含有嘌呤等。根及根皮入药，味辛，苦，性温，无毒，主治风湿性关节炎、腰肌劳损等病。〔刘兴权，２００１〕本实验用热水浸提、酶法处理、再经醇析、Ｓｅｖａｇｅ法除蛋白，水相透析得到半精品多糖。脱蛋白后的半精品多糖先经ＤＥＡＥ－纤维素柱层析洗脱，得到脱色的精品多糖，再经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．２００葡聚糖凝胶柱层析洗脱后，得到四种分子量均一的纯多糖，并根据提取部位不同分别命名为：根〔ｓｕｂ—Ｇ№ａ〕、茎〔ｓｕｂ—Ｊｔｏｏ〕茎〔ｓｕｂ．ＪＮａａ〕、叶〔ｓｕｂ．Ｙ№ａ〕。应用红外光谱和高效液相色谱分析其组成成分，采用物理化学分析方法验证其理化性质，并证实了草本刺嫩芽多糖具有抑菌作用和抑制ｌｈＮａｓｅ的生物学活性。本实验的主要结论如下：１．采用水提醇沉法提取粗多糖，正交实验得出最正确提取条件为：料液比１：２４，温度９０℃，时间２ｈ，提取次数２次，此条件下粗多糖含量为３．７６％。２．采用酶法配合水提醇沉法提取草本刺嫩芽粗多糖：本实验应用纤维素酶液处理脱脂后的草本刺嫩芽全株干粉，发现当酶浓度到达７％，温度到达５０℃，时间为６０ｍｉｎ，ｐＨ为５．０时，多糖含量可到达４．３２％，要比常规法得率高出１５％。３．所提根、茎、叶三局部粗多糖的蛋白质含量分别为：根中蛋白质含量为３７．５６ｍｇ／吨，茎中蛋白质含量为５５．？３ｍｇ／ｍＬ，叶中蛋白质含量为１６．６１ｍｇ／ｍＬ。物化性质说明，草本刺嫩芽多糖为水溶性的无味粉末。斐林试剂反响，糖醛酸检测和Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ反响均显阳性，碘二碘酸钾反响中只有根多糖显阳性。４．将三局部脱蛋白多糖进行ＤＥＡＥ一纤维素柱层析，每局部分别用蒸馏水、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ和０．５ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ０Ｈ洗脱，得到的九种级分可作为ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００样液。经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一２００进一步纯化，得到含量较多，峰形均一对称的四种亚级分：根〔ＧＮ，Ｏ〕、茎〔Ｊｍｏ〕、茎〔Ｊｎａａ〕、叶〔ＹＮａＯ〕，通过ＳｅｐｈａｄｅｘＣ，．－２００凝胶过滤法和醋酸纤维薄膜电泳法进行纯度鉴定，证明为均一多糖。５．红外光谱分析显示四种纯多糖不含硫酸基团和乙酰基，具备Ｂ一糖苷键以及糖类特征吸收峰。ＨＰＬＥ分析得出：根的Ｎａｃｌ洗脱多糖组分为Ｄ一半乳糖醛酸、Ｄ一果糖、Ｄ一葡萄糖，茎的水洗脱液多糖组分为Ｄ一甘露糖、Ｄ一半乳糖醛酸，茎的ＮａＣｌ洗脱多糖组分Ｄ一葡萄糖、Ｄ一半乳糖，叶的洗脱多糖组分为Ｄ一半乳糖醛酸和Ｄ一山梨糖。草本刺嫩芽多糖的提取纯化及其性质研究摘要６．三部位多糖的性质研究：抑菌试验显示草本刺嫩芽多糖对青霉菌具有抑制作用；多糖对核糖核酸酶的抑制作用实验说明，草本刺嫩芽的叶多糖成分可以较显著的抑制核糖核酸酶的活性。关键词：草本刺嫩芽，多糖，别离纯化，结构分析，性质沈阳农业大学硕士学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＡｒａ／／ａｃｏｎｔｍｅｎｔａｌｉｓ．ｋｉｔａｇｉｓｎｕｔｒｉｔｉｏｎｓＡｒａｌｉａｏｅａｅｐｅｒｅｎｎｉａｌｈｅｒｂａｇｅａｎｄｓ础ｗｎｃＩ岵Ｉｔ’ｓｒｏｏｔ，ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｈａｖｅｖｏｌａｔｉｌｅｏｉｌ，ｔｈｅｒｅｉｎｔｏｒｏｏｔｉｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ２％．ｓｔｅｍｉｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ０．５８％；ｌｅａｆａｎｄｓｔｅｍｈａｖｅｆｌｖｏｎｅ．ｃｏｕｍａｒｉｎ；Ｒｏｏｔａｎｄｓｔｅｍｈａｖｅｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ：ｓｔｅｍｐｅｅｌｈａｖｅｔａｎｎｉｎ；ｒｏｏｔｃｏｎｔａｉｎ１９．４％ｓｔａｒｃｈａｎｄＳｏｌｕｂｌｅｓｕｇａｒ１．６９％ｅｔｃ；ｆｒｕｉｔｃｏｎｔａｉｎｐｗｉｎ．Ｒｏｏｔａｎｄｐｅｅｌｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｔａｓｔｅｉｓｐｕｎｇｅｎｔａｎｄｂｉｔｔｅｒｎｅｓｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｍｉｌｄｎｅｓｓｉｎｎｏｃｕｉｔｙ．ＴｒｅａｔｍｅｎｔｃｕｒｅｄｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓｓｔｒａｉｎｏｆｌｕｍｂａｒｍｕｓｃｌｅｓａｎｄＳＯＯＩＬＡｒａｌｉａｃｏｎｔｉｎｅｎｔｕｌｉｓｔｈｅｅｓｔｉｍａｔｅｏｆｅｃｏｎｏｍｙｖａｌｕｅｉｓＰｒｅｓｅｎｔｌｙ，ｆｅｗｏｆｓｔｕｄｉｅｓｒｅｓｐｒｎｔｅｄ．，ａｎｄｏｎａｒｅｆｏｕｎｄｅｄａＩｅａｌｏｒｎｌｏｕｓｇｒｏｐｉｎｇｓｐａｃｅｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｐｒｏｄｕｃｔｏｆｏｎｍａｃｒｎｓｃｏｐｉｃａｌｌｅｖｅｌ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ．Ｔｈｅｒｅｈｅａｌｔｈ，ａｎｄｔｈｅｐｈａｒｍｉｃｅ蚯ｃａｃｙｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｈａｄｂｅｅｎａｎｗｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．ＳＯｆｏｕｎｄａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｕｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔｈａｔｉｓｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔ妫铮?ｏｔｈｅｒａｃａｄｅｍｉｅｓｏｆｓｃｉｅｎｃｅｓｔｏｓｔｕｄｙｉｎｄｅｐｔｈａｎｄｍｏｒｅｅｘｔｅｎｓｉｖｅ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｅｔｈｏｄｏｆｅｘｔｒａｔｉｏｎｍｕｇｈｗｒｏｕｇｈｔｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎｃｌｕｄｅｂｏｉｌｌｉｎｇｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｐｒｅｃｉｐｉｍｔｉｏｎｗｉｔｈａｌｃｏｈｏｌｒｅｍｏｖａｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎｂｙｓｅｖａｇｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｗａｔｅｒｄｉａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅｍｕｇｈｗｒｏｕｇｈｔｐｅｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｓｓｅｐａｒａｔｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｐｕｒｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｏｎＤＥＡＥ－ｃｅＵｕｌｏｓｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００ｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｒｏｏｔｉｓｎａｍｅｄＧＮ日ａ，ｓｔｅｍｉｓｎａｍｅｄＪＨ２０ａｎｄＪＮａＯ，ｌｅａｆｉｓｎａｍｅｄＹＮ－ａ．ＴｈｅｎｐｏｌｙｓａｃｅｈａｒｉｄｅｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｉｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＩＲｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ，ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｗｉｔｈａｌｃｏｈｏｌ，ａｎｄｔｈｅ１．Ｐｏｌｙｓａｃｏｈａｄｄｅｓａｒｅｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．ｗｈｉｃｈ１１８ｅｄ２４ｔｉｍｅｓｈｏｔｗａｔｅｒｔｏｅｘｔｒａｃｔ２ｈｉｎｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ９０℃ｔｗｉｃｅ．Ｉｎｔｈｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｅｒｃｅｎｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｓ３．７６％．２．Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ缸ｈａｎｄｌｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅｓａｎｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ，ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｗｉｔｈａｌｃｏｈｏｌ，ｄｒｙｎｏｎｆａｔ－ｐｅｗｄｅｒｏｆＡｒａｌｉａｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌｉｓｉｓｈａｎｄｌｅｂｙＣｅｌｌｕｌａｓｃ，ｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｔｈａｔｕｓｅｅｎｚｙｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ７％ｉｎｐＨ５．０ｔｏｅｘｔｒａｃｔ６０ｒａｉｎｉｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ５０‘Ｃ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｄｏｎｐｅｒｃｅｎｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｓ４．３２％，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｒａｄｉｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｉｔｉＳｍｏｒｅｔｈａｎｌ５％．３．ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＰｒｏｔｅｉｎｉｓ３７－ｓ６ｍｇ／ｍＬｉｎｒｏｏｔ，５５．７３ｍｇ／ｍＬｉｎｓｔｅｍａｎｄ１６．６１ｍｇ／ｍＬｉｎｌｅａｆ．ＰｈｙｓｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙｃｈａｒａｃｔｅｒｓｈｏｗｔｈａｔＡＣＰｉｓａｗａｔｅｒ·Ｓｏｌｕｂｌｅ，ｆｌａｖｏｕｒｌｅｓｓｐｏｗｄｅｒ；Ｆｅｈｌｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎ，ｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｔｅｓｔａｎｄＳｅｌｉｗａｎｏｆｆｒｅａｃｔｉｏｎａｒｅｏｂｖｉｏｕｓｂｕｔＩ－ＫＣｌ０３ｒｅａｃｔｉｏｎｉｓｔｏｒｏｏｔａｐｐａｒｅｎｔｐｅｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．４．Ｔｈｒｅｅ∞ｎｓｗｉｔｈｏｕｔｐｒｏｔｅｉｎｉｓｓｅｐａｒａｔｅｄｉｎｔｏｎｉｎｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｎＤＥＡＥ－ｃｅｌｈｌｏｓｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｂｙｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ，０．２ｍｏｌ／ｌＮａＣＩａｎｄ０．５ｍｏｌ／ｌＮａＯＨ。ｎｉｎｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｕｓｅａｓｓａｍｐｌｅｆｏｒＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００ｇｅｌ３摘要ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＴｈｅｎａｌｅｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００ｇｃＩｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｉｎｌｏｆｏｕｒｐｒｉｍａｒｙｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｋｕｒｔｏｓｉｓｓｕｂ－ｆｒａｃｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｙａｒｃＧＮａｃＬ，ＪＨ，ｏ，ＪＮａＣＩａｎｄＹＮ帕．Ｔｈｅｙａｒｅｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｔｅｓｔｅｄｂｙｇｄｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ０１１ＳｅｐｈａｄｅｘＧ锄Ｏｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．５．如ＰＬＣａｎｄＩＲｓｐｅｃｌｒｕｍａｎａｌｙ∞ｓｈｏｗｔｈａｔｆｏｕｒｐｏｌｙｓａｃｃｈｈａｒｉｄｅｓｈａｖｅＢ－ｉｎｄｉｃ．ａｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａｂｓｏｒｂａｎｃｅｏｆｇｌｕｃｉｄｅｗｉｔｈｏｕｔｖｉｎｉｏｌｒａｄｉｃａｌ、Ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃａｃｉｄａｎｄａｃｅ聊．ＧＮａａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗａｓｃｏｍｉｓＩｃｄｏｌｄ－ｇａｌａｃｔｕｒｏｍｃａｃｉｄ、Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ、Ｄ世ｕｃｏｓｅ，Ｊｍｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗａｓｃｏｎ螅椋螅簦澹洌铮妫模恚幔睿睿铮螅濉ⅲ模纾幔欤幔悖簦桑桑颍铮睿椋?ａｃｉｄ，Ｊ池ａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＷａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆＤ－ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｄ·ｇａｌａｃｔｏ∞，ＹＮａａｐｏｌｙｓａｅｏｈａｒｉｄｅ’ＷａＳｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆＤ－ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ、Ｄ·ｓｏｒｂｏｓｅ．６．ＣｈａｒａｃｔｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｓｈｏｗｔｈａｔＡＣＰｈａｓａａｎｔｉｂｌａｓｔｉｃｆｕｎａｉｏｎｔｏｐｅｎｉｃｉｎｉｕｍａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｌｃａｆＡＣＰＯｎＲＮａ∞．Ｋｅｙｗｏｒｄ：ＡｒａＨａｃｏｎｔｉｎｅ睿簦幔欤椋螅耄椋簦幔纾穑铮欤螅幔悖悖瑁幔颍椋洌澹螅穑酰颍椋妫椋悖幔簦椋铮睢螅簦颍酰悖簦酰颍?ａｎａｌｙｓｉｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒ４沈阳农业大学硕士学位论文第一章概述多糖〔ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ〕是由１０个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖，来自于高等植物、动物细胞膜、微生物的细胞壁中的天然大分子物质，是所有生命有机体的重要组成成分与维持生命所必须的结构材料〔周世文与徐传福，１９９４〕。人们对糖的认识首先是把它看作食物中的能量来源〔ＫａｄｓｓｏｎＫ＆１９９２〕。近几十年来，通过研究膜的化学功能、免疫物质以及对新药物资源的寻找等，人们发现糖类在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料，更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能。因此糖的研究逐步活泼起来，一般来说，真菌多糖具有较高的抗肿瘤功能；而高等植物多糖的增强免疫调节作用较好；藻类植物都具有硫酸基，具有良好的抗凝血和抗肿瘤功能。其中，一些分子量在几千以上，具有很强生物活性的活性多糖的研究受到日益重视。这些活性多糖的生理活性、化学结构以及构效关系成为多糖研究的前沿阵地，取得了很大的进展〔黄芳与蒙义文，１９９６〕。近二十年来，由于分子生物学的开展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等，都有着密切的关系。多糖在医药上还是一种很好的佐剂。近年来又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用〔ＶｌｉｅｇｅｈｔｈａｒｔＪＦＣ．１９８４〕。此外它还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。因此，在开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用等的研究方面，人们做了大量的工作。目前，多糖的研究以日本、美国、德国、俄罗斯等国处于领先地位，我国的科学家们也做了不少工作。多糖产品也已投入市场，日本将香菇多糖、云芝多糖ＰＳ．Ｋ投入市场之后，多年取得了显著的效益〔谭周进与谢达平，２００２〕。植物多糖是由许多相同或不同的单糖以口．或Ｂ．糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动的四大根本物质之一，同维持生命功能密切相关。近年来，大量研究说明多糖除了有免疫调节、抗肿瘤的生物学效应外，还有抗衰老、降血糖、抗凝血等作用，且其对机体毒副作用小，因此，对多糖的研究已成为医药界的热门领域。因此，多糖的研究与开发已曰益引入注目。草本刺嫩芽臼ｒａｌｉａｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌｉｓ．ｋｉｔａｇ〕学名：长自极木，为五加科楹木属多年生草本植物，是营养丰富的名贵珍稀山野菜。具有祛风燥湿、解热镇痛、疏风活血、利尿解毒、镇惊补虚等功能。人工种植２年生植株能够开花结实，花期７～８月，果期９～１０月。１年生具有１个芽胞，生长出１个地上茎；２年生长２～３个更新芽；３年生长３～５个更新芽；４年生以上的可长５～１０个，每年春季留１个芽抽茎生长，其余嫩芽采下食用。目前对草本刺嫩芽的研究鲜有报道，其经济价值的估算也只建立在宏观水平，尤其是在保健品开发方面尚有巨大的探索空｜’日〕，而多糖的药学成效己成为先进药学研究的新的指航标，所以，本试验建立的结论对今后该物种进一步广泛利用是非常有必要的。第一章概述１．１植物多糖的研究进展１．１．１植物多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理，一般先参加甲醇或１：１的乙醇乙醚混合溶液或石油醚迸行脱脂，含色素较高的根、茎、叶、果实类需进行脱色处理，然后用水、盐或稀碱水在不同温度下提取，应防止在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。一般植物多糖提取多采用热水浸提法，所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物〔张晓静与刘会东，２００３〕，１．１．２植物多糖的别离和纯化分级沉淀法利用不同多糖分子大小和溶解度不同而别离，常用的有季铵盐沉淀法和有机溶剂沉淀法。如安络小皮伞粗多糖的纯化方法〔陈广西与张翼伸，１９９２〕，在多糖溶液中参加不同浓度乙醇溶液，得到多个多糖；天门冬冷水浸提物〔陈部昌等。１９９４〕采用丙酮分级沉淀法得到３种多糖；铁皮石斛多糖〔黄民权等，１９９４〕采用的就是溴化十六烷基三甲胺〔Ｃｍ蛔〕络合精制而得。‘１．１．２．１除蛋白·用水或稀碱水提取的多糖常含有蛋白质，常用除蛋白质方法有Ｓｅｖａｇｅ法、三氟三氯乙烷法或三氯乙酸法。用Ｓｅｖａｇｅ法除蛋白的有南沙参多糖〔陈谦等，２００２〕、银杏白果多糖〔陈群等，２００２〕等。用三氯乙酸法除蛋白的如慧苡仁多糖〔徐梓辉等，２０００〕．桑叶多糖〔赵骏等，２０００〕，半枝莲多糖〔许益民等，１９９２〕等。１．１．２．２脱色多糖中常含有一些色素〔游离色素或结合色素〕，根据其不同性质采取不同的方法。常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法〔纤维素、硅藻土、活性炭等〕。ＤＥＡＥ－纤维素是目前最常用的脱色方法，通过离子交换柱不仅到达脱色的目的，而且可以别离多糖；Ｈ２０２是一种氧化脱色剂，浓度不宜过高且在低温下进行，否那么引起多糖的降解；如红毛五加多糖〔施亚琴等，１９９４〕采用的就是这种方法脱色，对于同时含有游离蛋白质和色素的多稽，可通过生成金属络合物的方法，同时除去蛋白和色素，方法是参加费林试剂生成不溶性络合物，经别离后用阴离子交换树脂分解络合物：吸附脱色法也常用，如桑叶多糖〔赵骏等，２０００〕采用活性炭脱色。１．１．２．３柱层析法１．１．２．３．Ｉ纤维素阴离子交换剂柱层析法：常用的交换剂为ＤＥＡＥ一纤维素和ＥＣＴＥＯＬＡ－纤维素，分为硼砂型和碱型两种，洗脱剂可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液，其优点可吸附杂质、纯化多糖，并适用于别离各种酸性、中型多糖和粘多糖。如百合多糖〔赵国华等，２００２〕、北沙参多糖〔尤敏等，１９８７〕、太子参多糖〔刘训红等，１９９３〕等。沈阳农业大学硕士学位论文１．１．２．３．２凝胶柱层析法凝胶柱层法是根据活性多糖分子的大小和形状而对活性多糖进行别离纯化的。所以，一般在活性多糖的纯化中都采用先用阴离子纤维素柱层析纯化后，再用凝胶柱层析进行一步的纯化。常用的凝胶有葡聚糖凝胶〔Ｓｅｐｈａｄｅｘ〕和琼脂糖凝胶〔Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ〕，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到别离纯化，但不适宜粘多糖的别离。一般生药提取物得以别离多用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＥＡＥ．Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｓｃｐｈａｃｒｙｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ精致得到各种多糖。如灵芝多糖、附子多糖、白术多糖、山药多糖等〔友田正司，１９９０〕。１．１．２．４除杂纯化方法透析、超滤及超速离心选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析以及一定条件下的超速离心操作，可按分子大小将多糖样品分级，超滤和透析更常用于除去小分子物质〔鞠海等，２０００〕。１．１．３多糖的性质及结构分析１．１．３．１纯度测定多糖的纯度标准不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量，因为即使是多糖纯品，其微观也是不均一的，它的纯度只代表相似链长的平均配布，通常所谓的活性多糖纯品实际上是一定分子质量范围的均一组分。目前常用于活性多糖纯度鉴定的方法有比旋光度法、凝胶过滤法、高压电泳法、区带电泳、超离心法和毛细管电泳法等。多糖纯度鉴定中应用最多的是凝胶过滤法，多糖经凝胶层析得到一对称洗脱峰，那么证明该多糖是均一组分。区带电泳主要按多糖的电荷性质不同分级，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳。１．１．３．２含量测定国内多采用显色试剂．硫酸法，根据单糖、多糖及其衍生物在硫酸作用下水解，脱水生成糖醛类化合物，与酚类、芳胺类等缩合成有色化合物。苯酚．硫酸法生成橙黄色溶液，在４９０ｒｉｍ处有特殊吸收。如红毛五加多糖〔施亚琴等，１９９４〕、枸杞子多糖〔王强等，１９９１〕、石斛多糖〔李满飞等，１９９０〕等；蒽酮．硫酸法生成亮绿色溶液在６２０ｎｍ处有特征吸收，其蒽酮试剂需新鲜配制，如麦冬多糖〔张卫星与王乃化，１９９２〕、黄精多糖〔李遐方等，２００２〕等；咔唑－硫酸法用于测定糖醛酸，如银耳多糖〔吴梧桐，１９８９〕。国外用ＬＫＢ柱层析系统，用比旋度、视差折光及紫外检测器，各组分的峰位自动记录，别离效果好且方便。１．１．３．３分子量的测定由于多糖的性质往往与它的分子量大小有关，因而测定多糖分子量对研究和制备多糖尤为必要。多糖分子量的测定方法较多，常用的有渗透压法、蒸汽压渗透计法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶过滤法和超滤法等。由于多糖分子量一般是不均一的，所以采用不同性质测定方法所得的结果也存在一一定的差异〔张惟杰，１９９９〕。第一章概述１．１．３．４多糖的结构１．１．３．４．１多糖的结构层次糖的结构分类沿用了蛋白质和核酸的分析方法。单糖是糖类的组成单元，单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分支连接成寡糖和多糖。寡糖和多糖的结构可分为一级、二级、三级、四级结构。多糖的一级结构是指糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等〔吴东儒，１９８７〕〔张惟杰，１９９９〕。多糖的二级结构是指多糖骨架链问以氢键结合的各种聚合体，通常糖苷键有两个可旋转的主链二面角，二级结构关键在于确定其取值。多糖链一级结构的重复顺序由于糖单位的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作用，导致有序的二级结构空间有规那么而粗大的构象，即是多糖链的三级结构。多糖的四级结构是指多聚链间非共价键结合形成的聚集体。１．１．３．４．２多糖的结构分析测定糖链的一级结构，即糖链的序列分析。包括化学方法——Ｓｍｉｔｈ降解、高碘酸氧化、甲基化反响、局部酸水解等；物理学方法一红外光谱、核磁共振、气相色谱、质谱等：生物学方法一工具酶的应用、免疫学方法等等。随着现代分析技术的开展，新技术不断的被应用到多糖结构分析中来，使得糖链一级结构的测定工作进展甚快〔张惟杰，１９９９〕。１．１．３．４．２．１化学方法：水解法：将多糖链通过完全水解分解为各个单糖，是分析多糖链组成成分的主要手段。水解法包括完全酸水解、局部酸水解、乙酰解和甲醇解等。Ｉ〕完全酸水解：将多糖以强酸试剂作用，在一定温度下〔８０，１００℃〕进行完全酸水解〔４－１０ｈ〕。水解之后的多糖经中和、过滤，可采用纸层析〔ＰＣ〕、薄层层析〔１１￡〕、气相色谱法〔ＧＣ〕、液相色谱法〔ＨＰＬＣ〕和离子色谱法进行分析。ＩＩ〕局部酸水解：利用多糖链中局部糖苷键如呋喃型糖苷键、位于链末端的糖苷键和支链上的糖苷键易水解脱落，而构成糖链的主链重复结构的局部和糖醛酸等对酸水解那么相对稳定的特点，对多糖常采用局部酸水解法处理。多糖经局部