第一章 生物反应器

学习方式老师课堂讲授同学们分组、分专题讨论期末考试小组讨论作业考勤生物工程下游技术我国开展生物技术产业，迫切需要两方面人才：从事实验室研发的“上游学术人才〞，能帮助提升中国的生物科技水平；熟悉科技成果产业化操作的“下游工程人才〞，能及时将科技成果产业化。重要原因之一：企业管理、市场营销以及金融投资方面的人才大多不懂生物技术，同时专业的生物技术人才又不懂市场开发。“上游开发〞仅比国际水平落后3—5年，而“下游工程〞却至少相差15年以上。中国生物技术与兴旺国家的差距之一：研究与市场脱节第一讲生物反响器课时：2节课主要内容：生物工程下游技术课程的简介〔理解〕生物反响器的一些概念〔掌握〕生物反响器的根本类型〔掌握〕细胞生长及代谢过程动力学〔了解〕生物反响器的设计〔难点〕生物工程专业知识体系上游基因工程：从基因之分子层次，开发生物系統菌种分离、鉴定保存与育种技术蛋白质工程：蛋白质分析、結构、功能、合成等，

以及从分子层次改变酶及蛋白质之特性中游細胞培养与細胞工程：动植物細胞及微生物培养技术

发酵工程：发酵最适化、发酵控制微生物工程：菌种、培养基、发酵工艺、杂菌下游酶工程：酶催化性质、酶固定化和修饰、新酶开发等生物反应器：设計、自动化免疫应用技术：抗原、抗体生物分离技术:产品回收、纯化、制备、放大、试产生产。生化检测分析技术生物工程下游技术概念狭义：专指生物物质产品的别离纯化技术。主要包括细胞破碎、固液别离、膜别离、层析技术、电泳技术等。广义：生物反响器、生物物质别离、产品分析检测及质量监控。目前尚无明确概念何谓生物反响过程？广义上一切动植物、微生物的生长繁殖都可以看作是生物反响过程。狭义上指那些能够应用于生物工业中的过程。生物反响过程原料的预处理及培养基的制备生物催化剂的制备

生物反响器及反响条件的选择。

产品的别离与纯化

上游加工过程中游加工过程下游加工过程细胞或酶等生物催化剂〔游离或固定化〕生物反应器空气CO2等冷却水原材料培养基灭菌底物产物废物除菌检测和控制产物预处理产品提取或液化副产物一般生化反响过程过程分类酶促反应过程微生物反应过程动植物细胞反应过程废水生物处理过程反应水平分子水平细胞水平细胞水平群体水平反应复杂性简单较复杂复杂很复杂底物、产物数量较少较多较多很多反应速度较快较快较慢很慢生物反响过程的分类生物反响过程的特点：⑴常温下进行，操作条件温和，勿需防爆。原料以碳水化合物为主，不含有毒物质。⑵以生命体的自动调节方式进行，多个反响像一个反响一样，可在单一设备中进行。⑶容易进行复杂的高分子化合物生产，如酶、光学活性体等。⑷能高度选择性地进行复杂化合物在特定部位的反响，如氧化、复原、官能团的导入等⑸生产产品的生物体本身也是产物，富含维生素、蛋白质、酶等。⑹生产过程中需要注意防止杂菌污染，尤其是噬菌体的侵入，以免造成很大的危害。⑺通过改进生物体生产性能，可在不增加设备投资的条件下，利用原有的生产设备使生产能力飞跃上升。第一节根本概念一、生物反响器:利用酶或生物体〔如微生物、动植物细胞〕所具有的特殊功能，在体外进行生物化学反响的装置系统。如实验室或工业生产中用于细胞培养的装置〔方瓶、锥形瓶、发酵装置、琼脂斜面〕。

作用：为细胞代谢提供一个优化的物理化学环境,使细胞更快更好地生长,得到更多的需要的生物量或代谢产物。生物反响器与化学反响器的区别化学反响器：从原料进入到产物生成，需要加压和加热；高能耗过程。生物反响器：有酶和微生物的参与，常温和常压下进行化学合成；生物〔酶除外〕反响都以“自催化〞方式进行。超大发酵罐：高100米，直径7米，容积为4000立方米，犹如一座壮观的圆形塔。生物反响器首先在发酵工业中得到应用〔发酵罐〕。另一种是以固定化酶或固定化细胞为催化剂的酶反响器。生物反响器的应用★

Foodadditives

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Antibodies★

ProteinDrugs★

Healthfood

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Naturalspice

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Animalfeedadditives

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Industrialenzyme

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Cosmeticsmaterial

衔接实验室技术与工厂实际生长的桥梁使用高效率生物反响器的目的:提高产品的生成速率减少辅助设备降低生产本钱获得最大的经济效益编辑ppt二、研究生物反响器的目的〔内容〕确定为到达一定的生产目的需要多大的生物反响器，什么样的结构更好；〔设计〕对已有的生物反响器进行分析，到达优化的目的；〔优化〕分析各种生物反响器的数据，从而对细胞的生长、代谢等过程有更深入的理解。第二节生物反响器的根本类型一、根据培养对象的不同：微生物培养反响器动植物细胞培养反响器二、按操作方式：批式培养连续培养半连续培养〔一〕微生物培养反响器壳体控温局部搅拌局部通气局部进料口量测系统附属系统根本通气方式:浸没式鼓泡器,外表通气装置,膜反响器二种常见的微生物发酵装置：常规发酵罐(机械搅拌式),气体提升式发酵罐形式最简单的反响器:没有机械搅拌和通气系统的反响罐机械搅拌装置1、机械搅拌式发酵罐具有机械搅拌及压缩空气分布装置的发酵罐，目前最大的通用式发酵罐容积约为480m3。罐的混合——机械搅拌，促使培养基混合均匀，有利于增加气液接触面积，提高溶氧速率。对于双液相反响体系可提高液-液接触面积，另外还可促进传热与固形物料的悬浮。〔P11图1－8〕常规〔机械〕发酵罐是促使微生物生长的一种反响设备，广泛应用于制药、化工、食品等行业。日本味之素发酵罐：500M3

周口味精厂发酵罐：200M3

益力味精厂发酵罐：630M3

台湾味丹发酵罐：660M3李锦记（新会）食品有限公司包装生产线李锦记（新会）食品有限公司酱油发酵罐2、气升式反响器特点：无机械搅拌,减少了剪切作用对细胞伤害。易于清洗、维修，不易染菌，能耗低，溶氧效率高。气体从罐下部通入，借气体的升力带动流体在整个反响器内循环流动造成良好的混合。见P11图1-9。目前已广泛应用于生物工程领域的好氧发酵方面，由此生产的产品有单细胞蛋白、酒精、抗生素、生物外表活性剂等。以甲醇为原料生产单细胞蛋白高密度培养时混合不够均匀河南莲花味精集团公司使用的气升式发酵罐实验用气升式玻璃发酵罐〔实物〕气升式反响器种子罐(实物)某抗菌素制药车间的一级种子罐和二级种子罐右边为300L一级种子罐，左边为3000L二级种子罐10L台式发酵罐从人孔向发酵罐内鸟瞰图〔二〕动植物细胞培养反响器与微生物培养根本一样；动植物细胞比较娇嫩，有贴壁生长需要，对培养要求高，因而在选用及设计时要特别考虑：防止或减低机械搅拌产生的剪切力；气泡外表张力可对细胞造成伤害，通气时要防止气泡与细胞接触；进行pH调节或补料时要严格防止化学环境急剧变化对细胞的伤害；载体选择尤其重要。机械搅拌式生物反响器连续搅拌釜式反响器干扰素生产用动物细胞培养设备高效内循环生物反响器〔HCR〕新疆紫草细胞培养流程细胞在培养周期中的变化丹参发根生物反响器大规模培养技术丹参(Salviamiltiorrhiza)：活血化淤,通经止痛。丹参有效成分在原植物根中含量低、生长周期长。药用植物发根大规模培养的关键在于其生物反响器培养技术。发根培养已在搅拌、气升、喷淋床、雾化等形式的生物反响器中进行。南阳天冠酒精集团公司中央两个酒精发酵罐小型和大型生物反响器设计的不同点工程实验用小型反响器生产用反响器功率消耗不必考虑需认真对待反响器内空间因大量的控制、无此影响检测装置占去一定空间混合特性可不必考虑需认真对待换热系统较易解决较难解决中空纤维管式动物细胞微载体悬浮培养反响器中空纤维作为通气装置：空气在管内，氧分子通过半透性的管壁溶透到培养液中，供给动物细胞生长。培养液中不会产生气泡，可防止损伤动物细胞。假设在中空纤维管束中通入纯氧，那么传递能力还可以提高。培养液通过下层螺旋桨搅拌器缓慢搅动循环，微载体在培养液中保持悬浮状态。工业用生物反响器机械搅拌式反响器气举式反响器固定化酵素细胞反响器流动床生物反响器膜反响器搅拌式发酵槽填充床反响器：装填有固体催化剂或固体反响物用以实现多相反响过程的一种反响器。固体物通常呈颗粒状，粒径2～15mm左右,堆积成一定高度〔或厚度〕的床层。床层静止不动，流体通过床层进行反响。它与流化床反响器的区别在于固体颗粒处于静止状态。固定床反响器主要用于实现气固相催化反响，如氨合成塔、二氧化硫接触氧化器、烃类蒸汽转化炉等。底物产物底物产物流化床反响器二、生物反响器按操作方式分：批式培养连续培养半连续培养1、批式反响器：营养物与菌种一次参加进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。以机械搅拌式和气升式为最多。〔如实验室摇瓶培养〕优点：操作简单。缺点：细胞所处化学环境在培养过程中明显改变，营养物质在培养过程分布不合理；初期细胞浓度低增长慢，后期虽细胞浓度升高，但营养物浓度低而使生长不快。总的设备生产效率不高。2、连续培养反响器：不断地往反响器中参加营养物，利用罐中的菌体增殖得到产物，并不断采出。在良好的控制下，罐内菌体的增殖速度可以与采出速度相同而到达稳态。分为二类：恒化器连续培养：通过控制培养基中某种营养物质的浓度根本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断〞进行。恒浊器连续培养：通过光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行。3、半连续反响器：介于批式和连续培养之间，分二种方式：补料批式或流加过程：在批式培养过程中不断补入营养物，近年来常用，可解决营养物抑制及缺乏问题，提高设备效率；在补料的同时间断采出一定量的发酵液体产物，延长发酵培养时间。优缺点：连续和半连续培养有利于过程的优化及效率提高，但易污染，要严格控制。一、生物过程动力学：定量地描述过程的速率以及影响过程速率的诸多因素，包括细胞生长速率、各种基质消耗的速率、代谢产物的生成速率。第二节细胞生长及代谢过程动力学反响速率：单位时间物质浓度的变化量。细胞生长速率为dx/dt，代谢产物生成速率为dp/dt，基质消耗速率为ds/dt。比速率：单位浓度菌体在一定条件下引起的反响速率。表示为μ=dx/x.dt、qs=-ds/xdt、qp=dp/xdt。得率系数：两种物质得失之间的计量比。Yx/s，Yp/s。

二、细胞浓度：单位体积培养液中所含细胞的量(mol/L)或菌体的干重，表示为kg/m3。只有相对于均衡生长模型的细胞培养体系才可用细胞浓度这一表示方式。测量方法：直接测定法：细胞干重法、显微计数法、平板计数法、浊度法。间接测量法：测定细胞成分，如大分子物质细胞群体的描述模型：非结构模型〔最理想情况〕：细胞群体视为一种溶质结构模型：细胞之间无差异；细胞内有多个组分离散模型：不考虑细胞结构；各种细胞不均一实际情况：细胞之间不均一；细胞内部多组分均衡生长平均细胞均衡生长平均细胞均衡生长模型：不考虑细胞内部的结构，又不考虑细胞之间的任何差异；三、细胞均衡生长的动力学模型细胞生长模型；基质消耗模型；产物生成动力学模型。1、细胞生长模型(只用生物量或细胞浓度来描述细胞的量〕细胞生长动力曲线:延迟期、指数生长期、〔减速生长期〕、静止期、自溶期〔衰亡期〕。细胞生长动力学描述：〔数学模型〕比生长速率〔重要参数〕：μ=dx/xdt〔单位体积内单位量细胞经过单位时间增加的细胞量〕μ反映了菌体增长的能力，受菌株及各种物理化学环境的影响，μ与限制性底物浓度的关系定量表达为Monod方程：其中μm为最大比生长速率；Ks为Monod常数〔饱和系数〕，取决于环境条件〔pH,温度，离子强度等〕；根本上反映了比生长速率与底物浓度的关系，由Ks值又反映了比生长速率与环境的关系。不适于较黏稠的发酵液(另有模型〕。有二个以上限制性底物;有抑制性底物或抑制性产物存在时有不同的模型表示.2、基质消耗模型：基质包括：碳源、氮源、氧及其他营养源基质消耗包括：细胞生长〔合成新细胞〕、细胞维持生命、合成次级代谢产物。数学模型〔P6：式1-9〕式中右边各项依次表示菌体生长、维持及次级代谢所消耗基质的速率。3、产物生成动力学模型产物：主要指细胞培养过程中代谢生成的除细胞量外的产品；数学模型：dp/dt=α(dx/dt)+βx其中α、β是与生长及菌体有关的比例系数，与菌株及各种环境因素有关。第三节生物反响器的设计生物反响器设计的重要方面：改善生物催化剂更好的进行过程控制有更好的无菌条件能克服速度限制因素〔特别是热量和质量传递〕等。一、微生物反响器设计的根本要求〔8点〕〔1〕防止将需蒸汽灭菌的部件与其它部件连接，因为即使阀门关闭，细菌也可在阀门内生长；〔2〕尽量减少法兰连接，如有可能，应采用全部焊接结构，焊接部位一定要确实磨光，以消除积蓄耐灭菌的固体物质的场所；〔3〕防止死角、裂缝等情况，以防止固体物质在此堆积，形成使杂菌获得热抗性的环境〔4〕发酵系统的某些局部应能单独灭菌；〔5〕与反响器相通的任何连接都应采用蒸气加以密封，如取样口在不取样时也要一直通蒸气；〔6〕所有阀门要易清洗、易使用、易灭菌，比较好的阀们有球阀、隔膜阀和截止阀等；〔7〕反响器应始终保持正压以排除渗漏；〔8〕为了便于清洗，反响器主体应尽量简单。

二、生物反响器选型与设计的要点1、选择适宜的生物催化剂。包括了解产物在生物反应的哪一阶段大量生成、适宜的pH和温度，是否好氧和易受杂菌污染等。2、确定适宜的反应器形式。3、确定反应器规模、几何尺寸、操作变量等。4、传热面积的计算。5、通风与搅拌装置的设计计算。6、材料的选择与确保无菌操作的设计。7、检验与控制装置。8、安全性。9、经济性。

培养的细胞类型及其生长特性(动力学特性)目的产物是什么,其物化性质及其对别离的影响基质的成分及物理化学性质期望的年产量反响器类型温度范围pH范围需要溶氧量基质浓度产物别离方式决定了供氧、匀质、产物别离、抑制物去除三、生物反响器设计所要考虑的主要问题四、生物反响器设计的根本方法根据实验数据推论最正确方案;根据细胞培养动力学模型推论最正确方案;二者结合并互相验证五、生物反响器的放大比较放大：根据实验数据和数学模型，利用近似法那么和因次分析等手段，将实验室的小型设备获得的较高产量效率在大型生产设备里重现的方法。要解决的主要问题：气态氧向液相中传递的速率受到限制；营养物质不能及时保持均匀从而导致菌体生长的限制。1.氧的供给氧的供给常常成为菌体生长的限制因素深层培养中氧的供给是液体中溶解的氧，必须由气泡传给发酵液，其传递速率为：OTR=kLa(C*-C),其中KLa为传氧系数发酵反响器设计要求有尽量高的传氧系数传氧系数的测量有：直接测量法、动态法、亚硫酸盐氧化法2.罐内流体的混合罐内流体的混合：一方面是为了加强氧的传递，另一方面使流体混合均匀，防止局部过浓或过稀并强化菌体与营养物的接触。解决方法搅拌的设计及控制：优化反响器尺寸、操作条件等各方面以利于氧的传递和溶质的均匀具体方法：增加搅拌速率；增大通气量；通入纯氧；放出局部丝状体；添加少量水不溶性的比水有更高溶氧度的另一相，如十二烷生物反响器放大的一般原那么几何相似原那么；恒定等体积功率放大；恒定传氧系数放大；恒