0402 细胞培养用液

Chapter4AnimalCellCulture◆Biologyofcellsinculture◆Fluidforcellculture◆Standardcellculturetechniques◆Establishingacelllineorcellstrain◆Cellfreezingandrecovery◆AnimalCellEngineering◆Section2：细胞培养用液水和平衡盐溶液天然培养基合成培养基无血清培养基其它常用液培养基的配制一、水和平衡盐溶液1.蒸馏水玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水尽量减少开启次数存放时间不宜过长，一般不要超过2周最好现制现用2.平衡盐溶液〔balancedsaltsolution,BSS〕主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。Ringer、PBS、HanksorD-Hanks〔无钙、镁离子〕配制离散细胞的消化液和洗涤液时，宜用钙、镁离子含量低的或无钙、镁离子的溶液可配制成10×浓度的贮存液，用时稀释高压灭菌，冰箱保存浑浊或沉淀时，应重新配制成效：①维持渗透压；②提供缓冲系统；③提供水分和无机盐要求：①和培养物来源的动物血清相似；②等渗如：平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加新鲜配置的三蒸水或去离子水水至1000ml二、天然培养基培养基〔培养液〕是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。蛙胚延髓组织培养在青蛙淋巴凝块内天然培养基血清：提供营养和生长因子，促进细胞生长繁殖，粘附及中和有毒物质血浆：支持培养组织块及供给细胞生长的营养物质，现在不常用组织浸出液：可用鸡胚胎浸出液，含大分子核蛋白质和小分子氨基酸，能促进细胞生长水解乳蛋白：氨基酸含量高，由乳白蛋白质经水解得到淡黄色粉末，一般可配制成0.5%溶液。血清中的主要成分：①多种蛋白质〔白蛋白、球蛋白、铁蛋白等〕②多种金属离子③激素④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等⑤各种生长因子⑥其它不明成分优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染三、人工合成培养基●

常用种类：RPMI1640；DMEM；MEM；Eagle；199等合成培养液的成分氨基酸几乎所有细胞在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置－20度保存，用前参加培养液内。含谷氨酰胺的培养液在4度贮存2周以上时，应重新参加谷氨酰胺碳水化合物维生素无机离子其他培养时要加血清！四、无血清培养基无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清培养基的主要研制策略：在根底培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基的组成根底培养液替代血清的附加成分〔细胞外基质、激素、生长因子等〕向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清培养基尚处于研究阶段。目前，大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。五、其它常用液★消化液

胰蛋白酶溶液

EDTA溶液★pH调整液

NaHCO3液

HEPES液★抗生素液★消化液〔可含0.02%EDTA〕胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞别离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks或PBS缓冲液配制；常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用★0.02%EDTA溶液亦称Versen液。化学鳌合剂，对细胞有一定的离解作用。EDTA：乙二胺四乙酸二钠★pH调整液NaHCO3液：常用浓度7.4%、5.6%、3.7%。三蒸水配制，过滤除菌，塞紧瓶塞保存。NaHCO3+H2O→Na++HCO3-+H2O→Na＋＋H2CO3＋OH-→Na++OH-+H2O+CO2↑HEPES〔N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid〕液：一种氢离子缓冲剂，可较长时间保持缓冲作用。可按所需浓度〔一般10～50mM〕直接参加配制的培养液中。HEPES是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸〔MW=238.31〕，对细胞无毒性HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。★抗生素液在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制由于操作不慎所致的微生物污染。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内最终使用浓度为青霉素100单位/ml、链霉素100微克/ml〔双抗〕。可根据不同的污染物选择抗生素：如，制霉菌素一般配制成母液，用时稀释！〔除菌？〕计算：100ml培养基加50ulPS，母液浓度应配成多少？P每瓶80万U，可配〔〕ml母液？相应参加〔〕克S？六、培养基的配制培养液的种类生长培养液根本培养基80%-90%血清10%-20%抗生素〔青霉素100单位/ml和链霉素100µg/ml〕维持液根本培养基95%-98%血清2%-5%血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活〔消除补体活性〕：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌★培养基的配制举例RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2加血清〔终浓度10％〕

培养基粉末中一般都参加了酚红〔当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色；当溶液碱性时pH大于8.4呈紫红色〕，一种pH指示剂。★培养基的选择培养成败的