临床细菌学检验技术课件

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第一节细菌形态学检查

形态学检查是鉴定细菌的重要手段，主要有以下重要作用.※

细菌的初步鉴定※

为下一步鉴定作出重要提示※

对一些特殊病原体引起的感染可得到初步诊断

检查方法不染色检查：只能观察动力和运动状况.染色检查：菌体形态、大小、排列、染色特

性及特殊结构.

一、不染色标本的检查

1.压滴法（湿片法）→不可有气泡和外溢

2.悬滴法→可较长时间观察

3.毛细管法→主要用于观察厌氧菌的动力

L60～70mmd0.5～1.0mm

悬滴法

压滴法毛细管法二、染色标本◆清楚地观察细菌形态、大小及排列◆根据染色结果对细菌进行分类（一）常用染料：酸性和碱性（二）主要染色方法

1.革兰染色

2.抗酸染色

3.荧光染色

4.特殊染色

革兰染色：临床微生物实验室最常用、最经典的染色方法。1.原理1)细胞壁结构学说2)等电点学说3）化学学说→→→核糖核酸镁盐2.涂片的制作

涂片→干燥→固定（目的）3.染色方法：经典的染液的组成

初染→媒染→脱色→复染（又称对比染色）4.结果

革兰阳性菌→紫蓝色

革兰阴性菌→红色5、影响染色结果的因素

1)操作因素

2)染液因素

3)细菌因素

革兰染色过程革兰染色过程

一紫二碘三酒精第四复红皆水冲时间要看说明书阴性菌红阳性紫

第二节细菌分离培养和鉴定

一.培养基的种类和选择（一）.培养基的种类按物理状态分：

液体、半固体、固体培养基高层斜面高层斜面平板按用途分：基础、营养、鉴别、选择和特殊培养基

克氏双糖铁培养基

（KIA）（二）培养基的选择1.血平板（BA）2.巧克力平板3.中国蓝或伊红美蓝平板4.麦康凯平板（MAC）5.SS平板6.碱性琼脂或TCBS琼脂平板7.血液增菌培养基8.营养肉汤

二.分离培养

主要用于各种临床标本或培养物中有一种或多种细菌时，对某一种细菌进行分离，使细菌在平板上分散生长，便于观察单个菌落特性，也易于挑去单个菌落进行纯化（分纯），进行下一步鉴定和药敏试验等。

（一）．细菌的接种方法平板划线接种法

分区连续涂布自动接种斜面接种法倾注培养法穿刺接种法液体接种法分区划线

穿刺接种方法

斜面接种方法

液体培养基接种方法

生长现象固体培养基上：菌落、菌苔。液体培养基上：混浊、沉淀、菌膜。半固体培养基上：观察细菌的动力现象。细菌在液体培养基中的生长特征细菌的动力观察麦康凯上发酵乳糖麦康凯上不发酵乳糖细菌产生的色素金属光泽

拉丝现象

产H2S的菌株（SS）小菌落可能为肠道致病菌（不发酵乳糖）

迁徙生长现象巧克力平板

菌落特征1.大小2.表面3.透明度4.外形及边缘5.高度6.光泽7.乳化8.硬度9.色素10.气味11.溶血特征（二）．细菌的培养方法

■一般培养法（需氧培养法）

37℃，18～24h■CO2培养法：培养箱和烛缸

■厌O2培养法

注意：培养皿的放置方法烛缸法三.生化反应

临床细菌检验工作中，通过对细菌形态学检查、培养特性的观察，可作出初步判断，再根据不同种属细菌的代谢产物不同，利用手工的或自动化的鉴定方法进行生化反应，对绝大多数细菌可进行属、种鉴定。（一）碳水化合物的代谢试验1.糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同细菌分解糖（醇、苷）的酶各异，代谢能力产物各不同，有的不分解，有的仅产酸，有的既产酸又产气，利用此特点鉴别细菌。（2）培养基：0.5～1.0%糖类等，内有指示剂。（3）结果及应用：阳性记录方法

2.葡萄糖代谢类型鉴别试验（O/F试验）★

原理

细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧分子参加，在无氧环境下不能分解葡萄糖，称为氧化型;

在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解，称为发酵型，此型细菌在有氧和无氧环境下都能分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。★培养基：H-L培养基（O/F氧化-发酵培养基）阴性杆菌指示剂为溴麝香草酚兰；阳性球菌指示剂为溴甲酚紫。★

方法

★结果及应用

O/F试验结果发酵型

氧化型产碱型3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG）（1）原理：具有β-半乳糖苷酶的细菌，可分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下亦可检出。（2）试剂：0.75MONPG溶液（3）方法：取纯化菌落于0.25ml无菌生理盐水中，制成浓的菌悬液，加入一滴甲苯使酶释放，37℃5min，再加入等量的ONPG溶液，水浴20min-3h观察结果。（4）应用：主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定

知识延伸a

细菌分解乳糖需要两种酶，一种是半乳糖苷渗透酶，可是乳糖通过细菌的细胞壁进入菌体内另一种是β-半乳糖苷酶，可将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖，进而再分解。缓慢分解乳糖的细菌缺乏渗透酶，不能将乳糖快速运到细胞内所以需几天乳糖才能被分解。b乳糖：葡萄糖和半乳糖通过β-半乳糖苷键连接

ONPG：邻硝基酚取代了葡萄糖，其分子小很多可直接进入菌体内。4.七叶苷水解试验（1）原理：有的细菌可将七叶苷水解成七叶素和葡萄糖，前者与二价铁离子反应，生成黑色化合物（2）培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基（3）方法及应用5.甲基红试验（MR）◆

原理细菌在代谢糖的过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸的代谢有两种途径，一种是丙酮酸进一步分解成甲酸、乙酸、乳酸等混合酸，使PH降低到4.5以下，加入甲基红试剂显红色（阳性）。如果酸进一步转化为其它物质（醇、酮、醛、气体和水），或丙酮酸按另一途径代谢，则PH仍保持在6.2以上，加入甲基红试剂呈黄色（阴性）。◆

培养基：葡萄糖蛋白胨水◆

方法

将待测纯菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育后加入甲基红试剂，立即观察结果。◆结果应用6.V-P试验

◆

原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化生成二乙酰，二乙酰再与培养基中精氨酸、肌酐等所含的胍基结合，形成红色化合物（胍缩二乙酰）。

◆培养基：同甲基红试验

◆方法：将待测纯菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育后加入V-P试剂，35℃放置15～30分钟观察结果。

◆

结果与应用:同甲基红试验一起使用。葡萄糖的两种代谢途径

甲基红试验结果：左阴右阳V-P试验结果：左阴右阳(二)蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验（1）原理：细菌分泌的明胶酶（胞外蛋白水解酶）能分解明胶，使明胶失去凝固能力而液化（2）方法：将待检菌接种于明胶培养基中，35℃孵育24h到7日，每24h取出放入4℃冰箱约30min以上，观察有无液化。（明胶的凝固点20℃，高于24℃呈液化状态

）（3）应用

a肠杆菌科细菌鉴别

b厌氧菌鉴定

c非发酵菌鉴定常用

2.吲哚试验（靛基质试验）

★原理

具有色氨酸酶的细菌，可分解蛋白胨中的

色氨酸，生成吲哚（靛基质），吲哚与加入试剂对位二甲氨基苯甲醛作用，生成

玫瑰吲哚呈红色。

★

培养基

蛋白胨水培养基

★方法与结果：注意试剂的加入方法

★应用

主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

吲哚试验结果随着时间推移颜色会慢慢褪去3.硫化氢试验（1）原理（2）培养基（3）方法（4）结果及应用4.尿素分解试验（1）原理（2）培养基：酚红为指示剂（3）方法（4）结果及应用5.苯丙氨酸脱氨酶试验

★原理

细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸氧化脱氨生成

苯丙酮酸，后者与三氯化铁(10%)产生深绿色反应。★

培养基已用色氨酸作为替代反应。（深褐色经久不退）

★方法与结果

注意应立即观察结果，延长时间会引起褪色。

★

应用6.氨基酸脱羧酶试验

★原理

细菌分泌的氨基酸脱羧酶，使氨基酸脱羧生成胺和CO2，培养基变碱而指示剂发生颜色变化。★培养基

氨基酸培养基和氨基酸对照培养基。

★方法及

结果

测定管由淡桔黄变紫（溴甲酚紫）或由淡绿变蓝，而对照管黄色，则为阳性。★应用

第二管阳性（三）碳源利用试验枸橼酸盐（丙二酸盐）利用试验（1）原理：某些细菌能枸橼酸盐（丙二酸盐）为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，将其分解生成碳酸钠，使培养基变为碱性，指示剂溴麝香草酚兰由淡绿色变为深蓝色。（2）方法（3）结果及应用：阴性不生长且不变色

（四）各种酶类试验1.氧化酶试验

★原理

氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统中的最终呼吸酶。氧化酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色琨类化合物（二甲基为红，四甲基为蓝）。★方法与结果

1）滤纸片法

2）菌落法

3）试剂纸片法：制成干纸片，便于保存。

为保证实验结果的准确性，应设阴、阳性对照菌株。★应用

1）奈瑟菌属、莫拉菌属的鉴定

2）肠杆菌科、弧菌科、假单胞菌及其它非发酵菌的鉴别注意事项1.培养物应新鲜2.试剂应每周配制，空气中易氧化3.避免接触含铁物质4.不宜采用含葡萄糖的培养基上的细菌，因为葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性

氧化酶试剂及试验结果2.过氧化氢酶试验（触酶试验）★原理细菌分泌的过氧化氢酶，使过氧化氢分解成水和新生态氧，后者进一步形成氧分子出现气泡★方法与结果

3%的过氧化氢★应用主要用于革兰阳性球菌的初步鉴别★注意事项

①不宜用血平板上的菌落作试验，以免出现假阳性。

②不宜用陈旧的培养物，以免出现假阴性

③需设阴（链）、阳（葡）性对照

④试剂需新鲜配制

玻片法3.硝酸盐还原试验（1）原理：某些细菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，后者在与乙酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成重氮苯磺酸，在与α萘胺合成红色的萘胺偶氮苯磺酸。（2）试剂甲液：对氨基苯磺酸和乙酸乙液：α萘胺和乙酸（3）方法（4）结果

a加入试剂后显红色→阳性

b加入试剂后不显红色→加入锌粉显红色为阴性不显红色为阳性4.DNA酶试验

★原理

细菌产生的DNA酶，可使长链脱氧核糖核酸（DNA）水解成寡核苷酸。因为长链DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸则溶于酸，所以当在长有产酶菌落的培养基上加酸后，由于DNA已被水解，菌落周围出现透明环。★培养基

0.2%DNA琼脂平板★方法与结果

于DNA琼脂平板上点种待测菌，培养后，在培养基上加入1mol/L的盐酸覆盖平板，观察结果。出现透明环者为阳性，无透明环为阴性。★应用

①用于金葡菌的鉴定。

②用于G–杆菌的鉴定。（沙雷+、变形+）。DNA酶结果5.凝固酶试验（1）原理

◆结合凝固酶（凝聚因子）

◆游离凝固酶（2）方法（3）结果（4）应用

玻片法结果

试管法结果（5）注意事项1）玻片法为筛选试验，阴、阳性结果均需进行试管法。2）血浆必需新鲜。3）应使用EDTA抗凝血而非枸橼酸盐抗凝。有些凝固酶阴性的葡萄球菌和肠球菌可利用枸橼酸盐，使抗凝血再次凝固而出现假阳性结果。4）最好不用人血。存在潜在的感染因子和凝固障碍6.CAMP试验（1）原理：（2）培养基（3）方法（4）结果及应用（5）.注意事项◆血平板的质量影响试验结果，因此每次需同时做阴、阳性对照。◆指示菌只能用ATCC25923，而不能用其它金葡代替因为ATCC25923结果明显，其它金葡结果不典型，甚至出现假阴性结果。◆试验时必须将待测菌垂直于指示菌划线接种，否则结果不典型。7.胆汁溶菌试验（1）原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是胆汁降低了细菌细胞膜表面的张力使菌体裂解，也可能是胆汁加速了肺炎链球菌的自溶过程。（2）10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁（3）方法平板法35℃30min

试管法培养液0.9ml+0.1ml试剂，同上放置（4）肺链与甲链的鉴别

试管法

平板法胆汁溶菌试验结果（五）抑菌试验1.O/129敏感（抑菌）试验（1）原理：O/129对弧菌属和邻单胞菌属有抑菌作用，而对气单胞菌无此作用。（2）培养基：碱性琼脂平板（3）方法：10ug/片、150ug/片（4）结果与应用：属间鉴定O129敏感试验2.杆菌肽试验（1）原理（2）培养基（3）结果及应用

d﹥10mm敏感3.奥普托欣试验（1）原理（2）培养基（3）结果及应用不同药片判定标准不同（六）其它试验1.氢氧化钾拉丝试验

※原理

革兰阴性菌的细胞壁在强的稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈粘性，可用接种环搅拌后拉出丝来，而革兰阳性菌无上述变化。※方法与结果

4%的KOH溶液保存期限不超过一周

取一滴4%的氢氧化钾水溶液（应新鲜制）于洁净的玻片上再取新鲜菌落少许，与氧化钾溶液搅拌均匀，每隔几秒上提接种环，观察能否拉出丝来。能拉出粘丝为阳性结果（革兰阴性菌），仍为菌悬液者阴性（革兰阳性菌）。大多革兰阴性菌于5～10s出现阳性反应，革兰阳性菌60s以后仍为阴性反应。※应用

用于染色结果不明显的革兰阴性菌和革兰阳性菌的鉴别。

KOH拉丝试验结果2.克氏双糖铁试验（复合生化反应）

原理

克氏双糖铁（KIA）琼脂用于观察细菌对糖（葡萄糖和乳糖）的利用能力,以及是否产生硫化氢,可对细菌的种属进行初步鉴定。培养基方法

克氏双糖铁培养基

（KIA）克氏双糖铁培养基制成高层（下层）和短的斜面（上层）其中乳糖浓度为葡萄糖浓度的10倍，。如果细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，葡萄糖分解产生少量的酸，在最初培养的8～12h内也足以使高层和斜面变黄（酚红指示剂6.8～8.4，黄～红），但随着培养时间的延长，培养基斜面部分所产的酸因接触空气被氧