甘蓝型油菜抗菌核病的遗传研究及其基因定位

甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL油菜菌核病是由腐生性真菌(necrotrophicpathogen)核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)引发的，是世界范畴内多个作物的病害，也是我国油菜三大病害(菌核病、根肿病和病毒病)之首。我国油菜主产区特别是长江中下游油菜重要产区发病严重。油菜对菌核病的抗性由多基因控制，易受到环境和其它因素的影响。同时由于缺少抗性资源和精确可靠的鉴定办法，油菜抗菌核病的研究进展缓慢。因此，寻找可靠的鉴定办法，运用分子生物学技术手段定位油菜抗菌核病的数量性状位点(QTL)，对揭示油菜品种的抗菌核病机理、标记辅助选育高产优质抗病的油菜品种含有重要意义。本研究运用来自双低油菜品种华双5号和自选材料甲7005两个亲本杂交F1代衍生的的DH(doubledHaploid)群体，在苗期以及成株期进行了抗菌核病的表型鉴定，各生育期抗性鉴定办法比 苗期抗性鉴定比较了活体叶片菌丝块接种、离体叶片菌丝块接种、叶柄接种方法和子叶接种法；成株期采用终花期菌丝块鉴定。这些办法都能显示群体间抗感病差别明显。苗期2种接种办法不存在明显有关性，成株期接种办法和苗期离体叶片接种办法明显有关，成株期接种办法和苗期活体叶片不存在有关。甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的性状在不同生育期不同接种鉴定办法中均体现出正态分布，抗(耐)菌核病性状在家系间的表型差别达成极明显水平。抗(耐)菌核病性状在不同年份相似生育期相似接种办法之间达极明显有关：抗(耐)菌核病性状在不同生育期不同接种办法之间的有关性也达极明显水平。甘蓝型油菜抗菌核病的0TL对和2年2种接种鉴定办法的表型数据进行0TL2年成株期重复检测到的QTL位点有1个，位于C6连锁群上的同一种位点。种不同的鉴定办法重复检测到的0TL位点有2个，分别位于A3和A9华中农业大学2011Sclerotinia(stemrot)disease，causedbynecrotrophicpathogenSclerotiniasclerotiorum(Lib．)deBary，isaworldwidediseaseofmanycrops，andthetoponeofthethreemajordiseases，includingSclerotiniasclerotiorum，elubrootandvirusdiseaseinoilseedrape(Brassicanapus)．ThisdiseasespreadseriouslyintheYangtzeRiverAreaofChina，themainrapeseedproducingarea，causingsevereeconomiclosses．GeneticstudieshaveindicatedthatresistancetoSclerotiniaispolygenic，andvulnerabletoenvironmentalandotherfactors．Becauseofthelackofresistanceandaccurateandreliableinoculationmethods，thedevelopmentofrapeseedresistantbreedinghasbeenrestricted．Therefore，thesearchforareliableinoculationmethodandtheapplicationofmolecularbiologytechniquestolocateresistanceQTLsplayasignificantroleinrevealingthemechanismofresistancetoSclerotiniasclerotiorumandmarker-assistedbreedingofdiseaseresistantvarietiesofoilseedrape．Inthisstudy，resistantphenotypeandQuantitativeresistanceloci(QTL)toSclerotiniasclerotiorumWasidentifiedattheseedlingstageandmaturestageindoublehaploid(DH)populationsderivedfrommicrosporecultureofF1whoseparentswereHuashuangNo．5andJia7005．Themajorresultswereasfollows：ComparisonofdifferentinoculationTheresistancetoSclerotiniasclerofiorumatseedlingstageWasvaluatedwi廿lfourmethods，includingplacingmycelialplugsonleavesofliveplants，detachedleavesassay，petioleinoculationtechnologyandcotyledonassay．TheresistancetoSclerotiniasclerotiommatmaturestagewasevaluatedbymycelialplugsinoculationmethodstems．AllthesemethodswereeffectiveforidentifyingresistantandsusceptibleTherewasnocorrelationbetweenthedetachedleavesassayandplacingthemycelialplugontheleavesofliveplants．Therewassignificantcorrelationbetweendetachedleavesassayandmycelialplugsinoculationmethodsatmaturestage．GeneticanalysisofresistancetosclerotiniasclerotioruminBrassicaAllofthetraitsofresistance(i．e．tolerance)toSclerotiniasclerotiorumindifferentgrowthstagesanddifferentinoculationmethodshadshownanormaldistributionthephenotypicdifferencesamonggenotypesreachedasignificantlevel．Thecorrelationofthephenotypewiththesameinoculationmethodindifferentyearswascorrelationbetweentheresistance(i．e．tolerance)toSclerotiniasclerotiorumingrowingstageandwithdifferentinoculationmethodsalsoreachedasignificantMappingQTLsconferringresistancetosclerotiniasclerotioruminWiththedataofresistanttraitscollectedfromdetachedleavesassayandmycelialpluginoculationmethodatmaturestagein2010and2011，32QTLsweredetectedwithaLODscoremorethan2．5inthetwoyearsinDHpopulations，locatingn甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTLlakeagegroupA1、A2、A3、A6、A7、A9、C6、C8．髓esingleQTLaccountedforphenotypevariationfrom3．73％to41．81％．Amongthem，nineQTLswgretotallydetectedbydetachedleavesassayin2010accountingforphenotypevariation3．73％to13．07％．FourteenQTLsweretomllydetectedbymycelialplugmethodatmaturestagein2010，accountingforphenotypevariationfrom81％．NineQTLsweretotallydetectedbymycelialplugatmaturestageinaccountingforphenotypevariationfrom2．91％toTherewasonecommonlocidetectedinlinkagegroupC6bymycelialplugandtheotherWaslocatedonlinkagegroupA9．Keywords：Brassicanapus；Sclerotiniasclerotiorum；Resistanceindentification甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTt菌核病是世界范畴内多个作物的重要病害，菌核病是由腐生性真菌(necrotrophicpathogen)核盘菌引发的，能侵染75个科400多个植物物种，重要是双子叶植物，涉及某些重要的经济作物：豆科作物(大豆、菜豆、豌豆)和油料作物(油菜、向日葵)(BolandandHall，1994)。核盘茵感染寄主植物后产生超敏反映(hypersensitiveresponse，HR)或细胞程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)，抵抗病原菌的侵入，反而有助于病菌的进一步扩展(Kyoung，etal，)，这些特性近几十年来，油菜菌核病日益严重。在我国的长江中下游和东南沿海油菜重要种植区，菌核病造成的产量损失10％一30％，重病区高达80％，同时造成油份含量和质量减少(McCartnetetal，1999)。现在已有多个方法控制菌核病的发生：例如栽培管理、化学办法和品种本身的抗性。栽培管理能够避免或减少茵核病病情，但是只靠栽培管理本身并不是抱负的控制方法。化学办法对于菌核病的控制效果也不甚理迄今为止，大量育种学家研究和田间实验报道表明油菜没有发现免疫和高抗的种质资源，只有部分抗性或是耐病的育种品系(Zhao，)。筛选抗菌核病的油菜种质资源，特别是筛选适于多个研究规定的抗病材料的鉴定办法，是开展油菜抗菌核病遗传育种研究的基础。现在，分子标记和QTL定位在多个作物(如大豆、菜豆、油菜、向日葵)中用来拟定核盘菌的抗性位点。但是，这些报道中的单个QTL只能解释表型变异的--d,部分，并且依赖于测量环境，检测到的QTL不稳定，在不同的群体和不同的年份检测到不同的QTL。近年来由于分子生物学和基因组学的快速发展，油菜抗菌核病的研究获得了某些进展，国内外研究者通过QTL定位和基因体现分析，已经发现或分离出与抗性有关的基因，并获得抗性增强的转基因植株。华中农业大学201l叶柄鉴定办法源于Zhao(、)提到的叶柄鉴定办法。将4-5叶期的第三叶柄鉴定不用通过春化作用，周期短，办法易于掌握，培养室内可控制条件下不受自然环境干扰，适于大批量供试材料的接种鉴定，如种质资源，育种低世代材料，初级抗(耐)病材料等的初级鉴定。但供试材料接种后发病程度较严重，对寄主本身破坏性大极大，供试寄主植株接种后普通无再运用价值，某些低抗(耐)材料在鉴定中由于病斑扩展至材料死亡将被裁减，高感和中感材料可能差别不明显。草酸是核盘菌分泌的次生代谢产物，是核盘菌重要的致病因子。寄主植物对草酸的耐性程度决定了其对病原菌的抗(耐)性程度。草酸接种鉴定办法重要参考刘胜毅(1991、)提出的接种办法。其办法是：3_4叶期的油菜幼苗，在主茎底部剪断，将剪下的主茎放入装有5ml浓度为40mMOA的试管中。浸染48h后，用分光光度仪在518rim光波条件下测量浸染后OA溶液的吸光度。通过吸光度的变化来衡量油菜对菌核病的反映。明显特点是办法简朴、省力，可随意调节草酸浓度，这是菌体接种所不及的。并且实验过程操作简便和周期短，节省时间，且所需空间很小，适于大规模品种群2甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL子叶接种重要参考HarshGarg()提出的接种办法。菌落刚长至培养皿边沿时，用8mm打孔器打取新生边沿菌落，取7个菌丝块放入75ml无菌PDB养(25。C，120r／min)。培养3天后将菌丝块连同培养基一起转入50ml4000r／min室温离4],20min。用无菌ddH20清洗沉淀，于4000r／min室温离4M0min，集沉淀，清洗2次；将清洗后的沉淀倒入无菌的150mlPDB培养基中，用食品搅拌器低速搅拌3min；搅拌均匀的菌丝悬浮液用4层纱布过滤；然后用血球计数板将菌丝浓选。Garg()研究表明子叶鉴定的重复性好，与田间病情调查数据有关系数高但现在国内油菜对子叶鉴定的报道甚少，子叶鉴定体系尚不成熟。子叶接种周根据接种办法不同，可分为终花期琼脂块接种、终花期牙签接种(李强生，)、青角果期火柴棒接种(刘澄清，1991)以及花瓣接种办法(Heran，1999)等，这些接种办法的共同之处是接种于油菜茎杆。终花期将直径5mm琼脂菌丝块贴于接种于第2片和第3片无柄叶节间，或是用医用镊子在离地面50cm的茎杆处打孔后插入带菌牙签，接种3天后测量菌斑，以菌斑大小反映油菜对菌核病的抗(耐)性。青角期在茎杆距地面20～25cm处用电钻钻孔，然后把带菌火柴棒接种体插入孔中，接种后观察病斑沿茎杆的扩展状况。华中农业大学2011植株群体冠层形成的田间小气候。并且成株期接种要通过春花作用，周期长。接种后需要喷雾保持，田间湿度不均匀会造成测量时抗病差别。牙签接种接种会在植株茎上产生人为创伤，其外部防御系统受到破坏，使寄主的抗侵染和抗扩展能力有所(李强生，胡宝成，等，)。但是成株期鉴定成果与田间自然发病的正有关性明显，能较好的反映自然条件下田间菌核病的发病状况。核盘茵重要通过感染核盘菌子囊孢子的花瓣落在植株茎、叶上来侵染植株。花瓣接种理论上是一种很好的办法，模拟田间自然发病状况。对于避病型而言，费维新()通过3年对油菜重要栽培种的田间调查发现：花期晚的油菜品种感病几率较大。易倒伏油菜抗(耐)病性差，株型紧凑、株高较高的油菜发病几率较大。傅寿仲等(1993)病圃观察表明，甘蓝型油菜无花瓣品系的发病率较常规对照品种减少80％，由于花瓣消除后可形成形态避病，消除病原菌传输媒介。另首先花瓣消除后，植株中下部的透光率较常规品种增13185％以上，气温增加0．1—2．7。C环境的改善能形成“生态避病"。陈大伦()以育成的无花瓣油菜与有花瓣油菜采用病圃自然鉴定和人工接种鉴定进行对比实验。成果表明：在自然病圃条件下，无花瓣品系的叶片受侵染率明显低于有瓣品种，成熟期无花瓣品系菌核病危害程度均比现在公认的抗(耐)茵核病能力较强的对照品种轻或相称，比抗性较差的杂交油菜品种危害更轻：但人工接种鉴定表明，无瓣品系的病斑扩展速度均较抗性较强的有瓣抗(耐)茵核病能力较强的对照品种快。可见，即使无瓣品系本身并不含有较强的抗(耐)病性，但在花瓣消失后，其形态避病作用非常明显。陈玉卿(1994)通过田间调查表明不同类型油菜田间抗菌核病性的差别虽与花期气候条件有关，但白菜型油菜抗性差是由于苔茎叶和无叶柄全抱茎着生，短柄叶半抱茎着生，带菌花器脱落后极易卡在这两组叶片的叶腋内，加之叶腋常积水露，为子囊孢子萌发提供4甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL两组叶不抱茎，柄较圆，叶腋不易卡住花器，也极少积水露，叶片其它部位发病危及茎杆现象较少，因此花期病株率虽高，但至成熟期病株率和病指数却明显低于白欧洲品种。Mei(2011)通过比较芸薹属的3个基本种和3个复合种共68个品系，发现中用叶柄鉴定在中油821(CK)，NingRS．1，Major,andRV289抗(耐)性种质。赵建苷基因连锁，在双底油菜的选育过程中抗性基因丢失。CaixiaLi()在澳大利种质Fanl68，Fan028，Zhougyou．zaNo．8(中国)RR002，Ag．Spectrum，Oscar和品种中双9号的核盘菌抗性好于对照一中抗品种中油821现有的冬油菜栽培品种的抗性比春油菜抗性好，但是冬油菜栽培品种遗传背景相对较窄，没有好的抗病性资源，因此含有较广泛遗产背景的春油菜是较好的运用抗性遗传与QTL抗性变异还是广泛存在的．抗病品种的杂交实验表明，菌核病抗性是能够遗传的、5()(抗)×DHBa0604(感)组合P1、P2、F1、BCl、BC2和F26个世代群体菌核病的抗性，通过主基因一多基因混合模型分析，牙签接种3d的抗性受2对加性主基因+加性一显性多基因控制；接种5d的抗性由2对加性一显性一上位性主基因控制，显性及显性互作效应明显，无多基因修饰；接种3～5d的菌丝扩展抗性由2对加性一花瓣接种15d的抗性由2对加性一显性一上位性主基因+加性一显性一上位性多基因由于鉴定办法的限制和抗性资源缺少，油菜抗菌核病QTL定位研究进展比较缓慢，现在国内外对于油菜菌核病QTL定位的报告较少，并且，这些报道中的单个QTL只能解释表型变异的-d,部分，并且依赖于测量环境，检测到的QTL不稳定，在不同的群体和不同的年份检测到不同的QTL。刘春林()通过RAPD标记作图，以F2单株的抗病性作为指标，检测到3菌核病有关的QTL，分别位于第4、8、14三个连锁群上，解释的变异分别为13．8％、和15．3赵建伟()以宁RS．1(抗病)与恢5200(感病)构建的F2：3家系作为作图群体，运用运用区间作图法，检测到7个QTLs。其中与甘蓝型油菜苗期叶片的病抗性有关的QTLs3个，分别位于第15、14、12-Z．个连锁群上，解释的表形变异为27．2％、13．3％和14％。对成株期茎抗病性检测到4个QTLs，分别位于4的抗病性(SRM)检测到两个效应明显的位点，分别位于第20和第6连锁群上，解释的变异分别为39．9％和30．7％；对茎干抗病斑扩展速度检测到2个QTL，分别位于第3和第11个连锁群上，解释的表型变异为27．9％和17。4％。锁群上，解释的表型变异分别为23．2％、16．6％和13．6％。36甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL成株期花瓣法3种办法，和两年重复实验，用复合区间作图法共检测到19个抗性，位于分别位于Nl、N2、N3、N4、N5、N9、N10、N12、N15、N19等10个不同连锁群上，单个QTL解释的表型变异为9．54％一42．17％。检测到10个QTLs，其中苗期离体叶菌丝琼脂块接种检NN3个QTLs，位于第5连锁群的2个和位于第12个连锁群上的一种，解释的遗传变异分别为41．51％、9．54％和10．18％；病圃埋菌核鉴定成株期抗性，终花期未检测到抗性QTL，成熟前以病情指数为指标在第15个连锁群上检测到一种QTL，解释的遗传变异为18．78％。花瓣接种法共检澳JJN6个抗性QTLs，接种后10d在第15连锁群检测到1个QTL，解释的遗传变异为42．17％；接种后20d在5连锁群检测到1QTL9连锁群检NN2QTLs，解释的遗传变异分别为36．67％、13．75％、29．56％；成熟前病情指数在第12连锁群检测到2个QTLs，解释的遗传变异为14．88％、17．74％。苗期和成株期未检测到共同的QTL。检测N9个QTLs，牙签接种后检NN3个QTLs，分别为第3、5和第4连锁群上，解释的表型变异为16．38％、11．34％、24．69％：花瓣接种法检测到6个抗性QTLs，分别位于第21、10、19连锁群上，其中第1连锁群上有3个QTLs。解释的遗传变异10．40卜24．79但是两年的田间实验成果显示苗期抗性和成株期抗性以及两年成株期抗性未检测到Zhao和Meng等()运用部分抗性材料RV289与p1804(感病)性材料Major与Stellar(感病)构建的DH系(分别标记HUA群体和MS群体)群体，进行叶柄鉴定办法进行抗菌核病的QTL定位，以sn(茎干病斑长度)和dw(萎蔫天数)为衡量抗病指标。在每个群体重复3次。在HUA群体中，3次重复检NN7个与s11有关的QTLs，第一次重复检测N6个与sll有关的QTLs，分别位于N2，N12，N14，N16，N19．其中N14上检i贝tJN2个QTL位点；第二次重复检NN2个与s11有关的QTLs，分别位于N5和N16上；第三次重复检测到1个与sll有关的QTL，位于N16上。在N16上，三次重复都检测到与sll有关的QTL。在HUA群体中，3次重复检测到4个与dw有关的QTLs，分别位于N3，N12，N16，N19上。在MSi贝!JNQTI+，位于N3上，与s11和dw都有关。尹向瑞(，)--两年内成株期用3种接种办法(36．06％，分布在N4、N7、N10、N12、LGl37华中农业大学2011现免疫品种，但是存在部分抗病的品种或是品系。因此甘蓝型油菜存在耐病性和避病性。油菜的避病性普通与开花期、株型有关。黄继英(1990)系。表明：甘蓝型油菜以上生分枝、始花期偏迟、直立型及来自西欧的品种，自然发病较轻；下生分枝、始花期偏早、倒伏严重及来自加拿大的品种发病较严重。张洁夫(1994)等通过田间自然发病调查发现不同油菜种质资源对菌核病的抗(耐)性随着开花期的推迟而增强，不同类型种责问，群体开花期早的抗性差于开花期迟的。赵建伟()通过定位开花期的QTL，并比较开花期QTL与抗菌核病的QTL发现，双低油菜的释放使油菜菌核病的发病状况日益严重，油菜育种学家通过田间自然发病调查发现油菜种子中硫苷含量低的品种对菌核病的抗性明显减少。宋志荣()通过田间自然发病状况分析发现高硫苷品系的病情指数均极明显不大于低硫苷品系，但是高硫苷品系之间以及低硫苷品系之间的病情指数均无明显差别．这表明油菜硫苷特性与植株对菌核病抗(耐)性呈正有关。Zhao()通过定位硫苷含量位点，并比较分析硫苷含量位点和抗菌核病QTL发现，位于第17个连锁群上控制脂肪族硫苷含量的一种位点与苗期叶片抗性的QTL部分重叠，位于第7个连锁群上控制3一吲哚甲基硫苷含量的位点与成株期茎干抗性的QTL部分重叠。有关分析发现，硫苷含量与抗菌核病呈明显正有关，硫苷含量低的品种抗菌核病能力明显减少。即使在过去的研究中已经定位到与抗菌核病有关的QTL，但是植物对菌核病抗性的分子基础却是知之甚少。由于拟南芥与芸薹属植物同属十字花科，基因组的共线性程度高(油菜和拟南芥的蛋白质编码序列同源性8)并没有商业化使用，因此研究者运用拟南芥全基因组的微阵列来研究油菜抗菌核病的基因体现图谱，试图解释油菜抗菌核病的生化和遗传基础。赵建伟()用拟南芥全基因组微阵技术检测部分抗性材料RV289与感病材料Stellar接种核盘菌后的茎干组织基因体现差别，通过基因体现图谱分析发现差别体现的基因功效可能涉及致病性有关蛋白(PR蛋白)、与氧暴发有关的蛋白、蛋白激酶、分子转运蛋白、细胞维持和发育有关的蛋白等。在部分抗病和感病两种基因型中抗性反映体现为基因体现时间和数量上的差别。在两种基因型中差别体现基因的数目都随时间而增加，8甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTLYang()运用拟南芥寡核苷酸芯片技术研究油菜叶片接种核盘菌后的基因体现谱，发现与抗病有关的基因体现存在时间上的差别；种核盘菌后的材料明显差异体现的基因功效可分为5类：细胞拯救和防御的转录产物、转录因子、茉莉酸的生物合成和信号转道、细胞壁有关转录产物、其它转录产物。这些结论与赵建伟基因体现研究的结论相吻合。家族，甘蓝型油菜基因组由白菜基因和甘蓝基因构成，涉及大量的同源基因家族，WRKY、APETALA2(AP2)和MYB家族。在实验的两个品种中，编码茉莉酸、乙烯、生物素合成途径有关蛋白以及赤霉素降解有关蛋白基因诱导体现；另外编码碳水化合物代谢和能量代谢(这些代谢能将碳转化成三羧酸循环，并产生活性氧)有关蛋白的基因体现水平发生也变化；编码参加芥子酸和苯基丙酸合成有关蛋白的基因转录水平增加，表明次生代谢产物也是甘蓝型油菜防御菌核病的成分。内本身菌核病抗性基因体现的成果，因此可分离出植物本身菌核病抗性基因，并将其转移到其它植物中以产生对核盘菌小种的抗性。近年来，随着基因工程技术的发展以及油菜遗传转化体系的建立，许多学者已经通过基因工程的手段来研究如何提转化的抗性有关基因能够分为4大类，第一类：分解病原菌，从而克制病原菌侵入和扩展的有关抗性基因，重要涉及几丁质酶基因和葡聚糖酶基因。第二类：抑9华中农业大学2011制和分解病原菌分泌的次级代谢产物，从而克制病原菌的致病性，涉及草酸氧化酶基因和多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白基因。第三类：抗病有关信号通路转录因子，启动抗性有关信号通路基因的体现，涉及WRKY、MAPKs、EIN3。第四类：其它抗性有关基因，重要是单链抗体的应用。已知葡聚糖，几丁质是大多数病原真菌细胞壁的重要构造成分，葡聚糖酶(glucanase)和几丁质酶(chitinase)能够分解真菌细胞壁的这些重要构造成分，从而克制病原菌的生长繁殖，因此人们试图将几丁质酶基因和葡聚糖酶基因转入油菜品种中以达成抗真菌病害的目的。几丁质酶基因已被Oppenheim(1992)和G-rison(1996)分别成功地转到油菜和冬油菜中，并获得抗性增强的植株，且田间对菌核病耐性较好的油菜株系构成型体现几丁质酶基因。13-1，3一葡聚糖苷酶基因作为与植物防卫体系亲密有关的病程有关蛋白(PR)(a，b)运用农杆菌介导的转化办法，将抗菌核病的13-1，3株，活体接种核盘菌，成果表明部分转基因植株抗性比对照的明显增强。陈雁某些研究表明真菌分泌的草酸是核盘菌重要的致病因子，草酸缺失突变体不具有致病性和产生菌核的能力。草酸分泌物能够从几个方面增加核盘菌的致病能力。草酸能够酸化病菌感染部位，大多数真菌侵染过程中分泌的酶在低ph强，与钙离子结合形成草酸钙沉淀(Cessnaetal)，草酸作为菌核病扩展过程oxidase(草酸氧化酶)、oxalatedecarboxylase(草酸脱羧酶)、HydrogenPeroxid(过氧化氢)基因对茵核病抗性较好。现在在小麦、大麦中已分离出 oxidase基并将其转入油菜中，能够明显提高油菜对菌核病的抗性(XiangbaiDong，cta1．1995)。转入草酸氧化酶的甘蓝型油菜中，抗病有关蛋白蛋白、水杨酸途径有关蛋白等)基因的体现量比常规对照品种高(冀瑞琴，a、b)因，并克隆到38个BnWRKY甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL位子细胞核内。油菜中这些转录因子受病原菌和激素的诱导后，转录水平上调。但是现在只分离和克隆到转录因子，并未见其运用于抗病功效研究中。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen．activitedproteinkin嬲es，MAPKs)是一类号通路，造成植株对杀生性真菌一核盘菌的感病性增强。HengYinetal()用寡成型体现，用植物激素茉莉酸解决后，上调体现，而用水杨酸和ABA差别。Western杂交分析成果发现，BnOIPK在短时间内能被茉莉酸和寡壳糖诱导体现。从油菜品种中双9号中分离克隆出MAPK4基因，过体现MAPK盘菌的生长，构成型激活PDFl．2的体现，减少H202的产生，正向调节与茉莉酸信号转道有关的抗性反映，明显增强油菜对菌核病的抗性(Liu)，反义体现则减少近年来研究表明核盘菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶(oyaatrns，PG)在病菌感染植物过程中起非常重要作用，多聚半乳糖醛酸酶也是茵核病分泌的次生代谢产物，与草酸协同作用造成核盘茵侵染寄主植物。草酸能够减少环境pH，为提高PG的酶活性及降解植物细胞壁发明有利条件，酸化了的细胞间层妨碍多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白(polygalacturonaseinhabitorPGIP)的活性(王心宇等)。大多数植物能编码多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白基因，多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白能使病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶失活，从而制止病原茵的扩展。Hedegusetal()报道在油菜基因组中编码最少16个BnPGIP基因，这些基因在病原菌浸染、机械损伤和信号分子诱导的体现各不相似，但是大多数的基因与核盘菌的浸染有关。现在尚未见有关PGIP基因转化油菜品种的报道。乙烯是植物气体激素，它作为一种内源信号分子，与水杨酸、茉莉酸等介导的抗病信号转导途径互相作用，在植物抵抗病原茵侵染的防卫反映中起着非常重要作用。乙烯不敏感转录调节基因(ethyteneinsensitive3，EIN3)烯信号转导下游元件，其作为转录因子启动一系列转录级联反映，从而激活乙烯诱导的防御有关基因体现。许李明()克隆分离到拟南芥EIN3在油菜中的同源基通过传统育种手段或是生物技术手段实现的遗传修饰，已经成功地产生对菌核病抗性增强的油菜品种。现在已有研究者采用一种新的技术来转化油菜品种获得菌核病永久抗性的转化植株，这一技术重要集中在重组单链抗体的应用上。wil1Jam华中农业大学2011Yajima()从小鼠胰脏细胞中分离出菌核病特异性单链抗体，构建重组体现载体转化甘蓝型油菜，接种离体叶片和植株茎干，成果表明病斑大小在转基因植株中明显不大于未转化对照，转基因植株对菌核病的耐性明显增强。现在油菜抗菌核病的基因工程研究中，除MAPK基因外，大多是转化外源的抗性基因，对于油菜内源抗性基因转化的研究有待进一步提高。由核盘菌引发的油菜菌核病是油菜中最重要的病害，我国油菜生产过程中由菌核病引发的损失严重。现在在油菜中没有发现免疫或高抗品种，对菌核病抗性的遗传规律尚不清晰。因此开展油菜抗菌核病的遗传规律研究和QTL定位对于油菜抗菌核病育种含有重要的指导意义。本研究将开展下列方面的工作：1．比较几个惯用油菜抗菌核病鉴定办法的可行性和可靠性；2．对DH系群体进行茵核病抗性鉴定，分析抗性遗传规律；3．运用油菜遗传连锁图基础初步定位甘蓝型油菜抗菌核病的QTL。上述研究将对进一步认识油菜抗(耐)菌核病的规律，鉴定抗菌核病的基因资源以及有效开展菌核病的抗性鉴定提供参考数据，可为油菜抗茵核病基因的精拟定位，揭示抗茵核病的遗传规律以及抗菌核病的分子机制奠定基础。”蓝犁油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL2抗性鉴定群体：从190个作图群体中随机挑选71蓉年3月播种于20cm直径的白色颦料钵中，每个DH系材料种植6 病斑长度(SLL，stemlesionlength)作为抗性鉴定指标。接种后每天观察统计萎蔫华中农业人学201l届颁Ij图1叶柄接种示意办 图2离体叶片接种示意办Fig．1．DiagrammicsketchofpetioleFig．2．Diagrammicsketchofdetachedleavesinnoculationmethod innoculationmethod苗期离体叶片琼脂块接种法实验材料于lO月播种于华中农业大学油菜实验田，随机区组设计，三次重复。取7—8叶期健康新生II一卜片(普通为倒数第2片完全展开叶)，每个DII系材料选用健康1I．片片，重复次，选用叶片时注意叶片大小利节问位点尽量保持一敏。叶柄基部厂玎纱布保湿。将4。C保存的菌株在PDA培养基上活化一次，继代一次。菌落长至培养皿边沿时，用8mm打孔器打取新生边沿菌落接种于叶片的中上部并偏离主叶脉处，接种时菌丝块菌丝面贴向叶片表面。接种后喷雾用塑料薄膜覆盖保湿，放置于20℃暗室中(图2)。44h和68h后分别测量菌斑直径(垂直方向测量2次，计算而积)。苗期活体叶片菌丝块接种中农业大学油菜课题组玻璃温室中进行。将供试实验材料播种于20cm直径的塑料钵中，每个DH系材料6株。待实验材料长至7-8叶期时，在倒数第2片完全展开叶上进行接种鉴定，重复两次。将4℃保存的菌株在PDA培养基上活化一次，继代一次。菌落长至培养皿边沿时，用8mm打孑L器打取新生边沿菌落接种于叶片的中上部并偏离主叶脉，用大头针将琼脂块固定在叶片上，接种时菌丝块菌丝面贴向叶片表面，然后喷雾用塑料薄膜保湿。44h和68h后测量菌斑(垂直方向测量2次，计算病斑圆面积和椭圆面积)。子叶接种子叶接种重要参考HarshGarg()提出的子叶接种办法。菌落长至培养皿边沿时，用8ram打孔器打取新生边沿菌落，取7个8ram菌丝块放入75mi无菌PDB培养基中震荡培养(25℃，120r／min)。培养3天后将菌丝块连同培养基一起转入50ml离心管中，于4000r／min转速下室温离心20min。用无菌ddH。0清洗沉I．蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL淀，于4000r／min转速下室温离心lOmin，收集沉淀，清洗2次；将清洗后的沉淀倒入无菌的150mlPDB培养基中，用食品搅拌器低速搅拌3rain；搅拌均匀的菌丝悬浮液用4层纱布过滤；然后用血球计数板将菌丝浓度调制104片段／ml；用调节好的菌丝悬浮液浸染已经完全展开的lO天左右大小的子叶，在每片子叶上用lOul移液器两边各接种lOul菌丝液。喷雾保湿。2天后测黾菌斑大小。以上过程均在人工气候室中进行。白天温度22℃，夜间20℃，光照强度10001ux，光周期为16h／8h对湿度保持在75％。的已知抗性的品系或品种：华双5号、甲7005、华双5号和甲7005配制的F1、中将4℃保存的菌株在PDA培养基上活化一次，继代一次，用8mm缘菌落放于长lOcm、宽5cm的保鲜膜上，接种于50cm将菌丝块固定，不要让菌丝块暴露于空气中，喷雾保湿，并用纱网覆盖。接种后4天开始调查病斑直径，调查3次。抗菌核病QTL后期的抗菌核病QTL定位由苗期离体叶片鉴定和成株期琼脂块鉴定数据进行扫描，由于在上诉多个接种办法的比较中发现，只有苗期离体叶片鉴定办法和成株期琼脂块鉴定办法稳定性和重复性优良，能够用于抗荫核病QTL定位。用SAS(version9．1．3)对数据进行方差分析和有关性分析。PROC程序用来进行群体数据的正态分布检测；PROCANOVA程序用来进行单因素方差分析，分析各品种或家系间抗病差别性。PROCCORR程序用来分析多个鉴定办法以及多个鉴定指标之间的有关性；PROCGPLOT程序来做茁期离体叶片和成株期接种鉴定的线性回归分析。华中农业人学坝I3towilt)以及茎干病斑K度(SLL，stemlesionlength)作为鉴定鉴定指标。接种后8h分生组织出现萎蔫黄化一_【二部组织瘫软，倒伏，整株萎蔫、黄化、死亡(图4)图3、叶柄接种后24h的病斑体 图4、叶柄接种后48h的病斑体Fig．3．Typicalhypersensitiveofpetiole Fig．4．Thephenotype 24hpost—inoculation 但是由于接种后气温较高，空气湿度较大，病斑扩展速度较快，在很短的时间内病情快速暴发，抗性较差的家系材料全部死亡(图四)。两种鉴定指标在实际操作过程中，无法进行数据统计。在接种第3天大部分植株萎蔫死亡，不同的DH无法显示出抗病差别。并且油菜植株在一种月大小时，呈现莲座状，主茎不明显，无法测量主茎病斑长度。此种鉴定办法在后续的研究中有待进一步完善。用离体叶片鉴定办法对71个DH家系进行菌核病抗性鉴定，用病斑直径、病斑面积(圆面积和椭圆面积)作为抗性鉴定指标。接种后12h能够在琼脂块大小范畴内叶片背面观察到褐色病斑，接种18h后能够在琼脂块周制观察到褐色病斑，在叶甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL养重要来自土豆培养基和腐烂的叶片组织。接种后44h大多数叶片病斑直径范畴为2-6cm，接种后72h多数病斑已经扩展到叶片范畴以外。44h和68h病斑方差分析显示各家系间差别明显，观察和统计分析发现44h为比较适宜的病斑测量时间，此时家系间抗性差别明显并且寄主植物有充足的时间启动本身的抗病防御机制。苗期离体叶片鉴定分别以3种鉴定指标(病斑直径、病斑椭圆面积、病斑圆面积)进行方差分析，方差分析显示3种鉴定指标在不同家系间的差别达极明显水平(p<O．0001)。有关系数分析成果显示，3种鉴定指标之间存在明显的一致性(表1)。2次重复间有关系数也达极明显水平(表2)。表 离体叶片接种办法3种指标有关系数分Table1．CorrelationCoefficientsbetweenofthreeresistanceparametersindetachedleavesinoculationmethods。表达0．01明显水平，一representsignificanceat0．01probability8’表达概 a)represent表2离体叶片2Table2．CorrelationCoefficientsbetweenoftworepuficationsindetachedleavesinoculationmethods重复椭圆面积 圆面积0．8039”0．7259 直径0．2477。0．2499”0．2164 重复椭圆面积0．2426。0．2512。0．2163。二 圆面积0．2519”0．2540。0．2204”0．9925。 。表达0．01明显水平，“representsignificanceat0．01probability 华中农业大学201l表3活体叶片鉴定2Table3．CorrelationCoefficientsbetweenoftworepulicationswith墅竺!垒壁堡璺垒!巳!垒竺i坠g磐!竺竺!i垒!壁望堕!旦!竺璺!重复 重复椭圆面 圆面 椭圆面。表达0．01明显水平，”representsignificanceat0．01probability8’表达概 砷represent通过离体叶片鉴定分析发现，3种抗性鉴定指标都能反映DH系对菌核病的抗性，但是在病斑扩展过程中观察到：叶片受病原菌侵染后，菌丝沿叶脉方向的扩展速度要快于在叶肉内的伸展速度，因此造成病斑的形状如不规则椭圆形。用椭圆面积和圆面积来计算病斑扩展，更能反映出菌斑的真实形成过程。并且在离体叶片分析中发现3种抗性指标有关性极高，都能反映叶片对茵核病的抗性，因此在活体叶片鉴定中采用面积作为抗性鉴定指标。用活体叶片鉴定办法对71个DH家系进行菌核病抗性鉴定，用病斑直径、病斑面积(圆面积和椭圆面积)作为抗性鉴定指标。接种40小时后测量菌斑大小，方差分析显示各家系间差别明显(p<O．0001)，有关性分析能够看出1次重复内的2定指标均达极明显水平，但是2次重复间没有有关性，表明活体叶片接种这种办法能够辨别各家系间的抗性差别，但是重复性差，鉴定办法不能重复，可靠性差(表3)，不含有作为抗性QTL定位的鉴定办法的条件。由于子叶接种办法是一种新的尝试，接种材料时选用已知抗性的品种或品系(在实验材料中已经列出)，而非上述几个接种办法中使用的DH系。接种后第二天甲7005出现褐色的坏死斑，但是斑点仅局限于子叶接种菌丝悬浮液的周边。接种后第3天，大多数子叶出现坏死或水渍状病斑，发病严重的子叶严重水渍化，子叶长满白色菌丝，严重萎蔫。而对照品种中双9号较抗品种则只是出现褐色坏死斑。由于子叶接种过程中，子叶面积小，茵丝扩展速度快，造成病斑经常会扩展至子叶范畴外植株顶端分生组织的生长点，造成病斑大小无法测量。在接种过程中菌丝悬浮液的浓度较难控制，浓度稍大，病斑容易扩展至子叶范畴以外，菌液浓度稍薷型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL，’’’lll警1L图5．子叶接种法接种3lesionsofvariousdiametersasassessed3dayspost-inoculationfollowinginoculationofBrassicanapuscotyledonswithwashedmaceratedmyceHumof存在周期短、室内可控制条件下进行、不受其它环境条件影响等优点，并且从初步成株期接种分别于和 1年终花期进行。接种后第2天菌丝开始侵以第一次测量病斑作为成株期茎干抗侵入指标，以8天和4表4成株接种后7天3Table4．CorrelationCoefficientsbetweenofthreerepulicationsinmyceliali望旦!竺!璺!!竺望堡竺!塾竺堡苎!垫巳壁竺!：i望竺竺望!7d— 7d一”表达0．01明显水平 一representsignificanceatO．Olprobability8’表达概 8’represent华中农业人学201l届硕l表5和2Table5．CorrelationCoefficientsbetweenoftwoyearsrepulicationsinmycelialpluginoculationmethodsin and20ll。表达0．01明显水平，”representsignificanceatO．Olprobability4’表达概 8’represent年接种后第7天、第10天分别测量病斑(微推迟，重要是由于2011稍滞后)，以接种7d测量病斑作为成株期抗病菌侵入指标，以第10天和第7发现3个重复间有关性达极明显水平(表四)。和2将苗期离体叶片抗性鉴定成果和2011年成株期抗性鉴定成果进行有关分析，成果显示成株期茎干接种后不同时期测量的茎干病斑直径与苗期叶片抗性存在明显有关，但是成株期病斑扩展速度与苗期叶片抗性却不存在明显有关(表6)。甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL表6Table6．CorrelationCoefficientsbetweendetachedleavesinoculationmethodmycelialinoculation苗期圆面 苗期椭圆面苗期直 成株201l一7d 201l- 苗期直径 成株201 0．22314。0．19883”0．23662 株0．19456”0．16914。0．20374。2011- 成株抗扩展0．79545”0．89595 。表达0．Ol明显水平，“representsignificanceatO．01probability砷表达概 砷represent油菜菌核病抗(耐)亲本与DH本研究中采用多个接种办法、多个抗性指标2年进行抗性鉴定比较，试图找到可靠的鉴定办法。在抗性鉴定办法的比较分析发现，苗期离体叶片鉴定和成株期鉴定能够作为抗性OTL定位的鉴定办法。在茵核病的遗传分析和OTL定位中采用190个DH群体的离体叶片鉴定办法和成株期鉴定办法。片直径大小从1．59cm到2．49cm，病斑椭圆面积大小从2．49cm2到5．74cm，病斑圆面积大小从2．37cm2-4．99cm2。成株期茎杆抗病性在接种7d后病斑长度从1．27cm10天，病斑的生长速度不同，从0．1cm到2．75cm 频数1

_咽曲一墨病斑圆面积 鼠u诮H融冒目 2融22 频1l 数频l5 C日 1i：!i：{．(J{：j974H：j7f)n 口2 _融鼠鼠I_口2O

㈧—日

频5国O 0．100．500．911．：{21．732．II201卜lOd病斑直径 病斑扩展速度图6抗病性在DHFig．6DistributionfrequencyofdiseaseresistanceintheDHpopulationsfI．omthecrossbetweenHuashuangNo．5andJia甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL表7亲本及群体抗(耐)Table7Descriptivestatistiesofdeseaseresistanceintwoparentsand

1两孺1—j性 年 办 华双5 甲 DH椭圆 离体叶 2．49-积圆面积 3 2．37- 直 1．59—成株 — 琼脂 101．5 1．27—病斑 度 1．4 11扩 0．卜。表达0．01明显水平，”representsignificanceat0．01probabilityDH采用2年2种不同的接种鉴定办法和鉴定指标对DH行有关分析，见图7和表 -i—成株期菌丝块接种后，4d病斑长度、6d病斑长度、8d病斑长度以及4—8d病斑扩展长度4种成株期抗性指标，其中前3项作为植株抗侵染的指标，4—8d病斑扩展速度作为植株抗扩展指标。方差分析显示这4项指标在190个家系间都存在极明显差别，4d病斑长度、6d病斑长度、8d病斑长度以及4．8d病斑扩展长度4项抗病指标之间存在极明显有关。苗期离体叶片接种的3项指标：病斑椭圆面积、病斑圆面积、病斑直径，这3项指标在190个家系中存在极明显差别，并且这3项指标之间存在极明显有关。2011年成株期菌丝块接种7d斑长度、lOd病斑长度以及7．10d扩展长度均存在极明显差别，并且7d和10d两个不同时期以及病斑扩展之间存在极明显有关。度之间均存在极明显有关，但是的病斑长度与2011年病斑扩展速度在病斑(4dpi6dpi)(8dpi)在图7中，以成株期7d、10d病斑大小和7．10d病斑扩展速度为例，进行苗期和成株期病斑大小的回归分析，由回归分析成果能够看出苗期病斑大小与成株期病斑直径线性回归明显，而与病斑扩展速度线性回归不明显，这与有关系数分析成果吻合。华中农业大学20ll届形!{坦 864一一年成株期J7(I病斑长度^星v

0 O苗期离体叶片病斑直释 } 成栋期】_。皿病斑长度【_雪I)32l】_二c^一病斑扩展速度^呈：

O图7Fig．7．Regressionanalysisbetweendetachedleavesandmycelialpluginoculationmethods表8DHTable8CorrelationCoefficientsbetweenofdifierentresistancecritirionanddifferentMy-6d成株期琼脂块接种后7天，meanssixdayspost．inoculationwithmycelialplugMy4—8d成株期琼脂块接种后4-8d扩展，meansfoursixdayspost-inoculationwithmycelialpluginc)DI-e离体叶片接种椭圆而积，meansthemeasureofareaofdeseaselesionellipsewithdetachedleavesmethodd)DI-c离体叶片接种圆面积，meansthemeasureofareaofdeseaselesioncirclewithdetachedleavesmethode)DI·l离体叶片接种病斑直径，meansthediameterofdeseaselesionwithdetachedleavesmethod华中农业大学2011234d病斑长度、6d病斑长度、8d病斑长度以及病斑扩展速度均存在明显有关。苗期离体叶片接种鉴定的3项指标与2011年7d、10d病斑直径存在明显有关，但是与7．10d病斑扩展速度不有关。以面苗期离体叶片接种鉴定与2011年成株期本实验所用的遗传连锁图谱由本实验室蔡光勤师兄等人构建。对406对SSR记的群体基因型分析，获得473个标记位点。用Mapmaker／Exp3．0连锁分析，458个多态性标记位点进入连锁群。构成一张涉及19个连锁群的甘蓝型油菜分子标记图谱。该遗传连锁图片全长1642．5cM，平均标记间距3．6cM。复合区间作图法检测到的为了验证抗菌核病基因型效应的遗传稳定性，对2年2种鉴定办法的各项指标所得的实验数据分别进行QTL扫描分析(LOD>2．5)。图7和表8列出了对苗期离体叶片抗病性和成株期茎干抗病性、茎干病斑扩展速度的全基因组QTL扫描的结果，2年内2种鉴定办法，共检测到32个QTLs，分别位于AI、A2、A3、A6、A7A9、C6、C8连锁群上。单个QTL解释的表型变异为3．73％41．81％，其中有位于A1连锁群上的4个QTLs是重叠的，都来自成株期接种鉴定4项指标(4d、个QTLs(位于同一位点)有部分区段重叠。位于C8连锁群上的位点有2甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL成株期琼脂块接种办法检测到的QTLs终花期采用成株期琼脂块接种法，以接种后4天、6天、8天的病斑长在A9连锁群上都检测到QTL，Zhao al()在C6连锁群上也检测到一种QTL4．8d病斑扩展速度检测到2个QTLs，分别位于A7和C6连锁群上，其中连锁群上的QTL与4d、6d、8d在C6连锁群上检测到的QTL重叠。由此成果能够看出，甘蓝型油菜抗侵入和抗扩展指标检测到的QTL不同，抗侵入重要是病原菌与寄主植物的物理作用，而抗扩展重要是寄主植物体内多个与抗病有关酶基因的体现。苗期离体叶片鉴定办法检测到的QTLs11月采用离体叶片接种办法对190个DH群体进行菌核病鉴定，以接种后44h病斑直径、病斑椭圆面积、病斑圆面积作为抗性指标。共检测到9个OZLs，分别位于A3、A9、C8连锁群上，解释的表型变异3．18％一13．07％，其中位于A9群上的0TL位点最大，其加性效应为0．73，表型奉献率为13．07％，这与成株期鉴定的成果相似，都在A9连锁群上检测到一种奉献率比较大的抗性位点，且在这一区段部分重叠；A3连锁群上检测到的位点与成株期接种后8d检测到的华中农业大学201lQTL位点重叠。来自亲本华双5号的抗性等位基因在在A3和C8上的位点对抗性起减效作用。其中病斑直径为抗性指标检测到3个QTLs，病斑椭圆面积和圆面积为抗性指标也都检测到3个QTLs，都位于A3、A9、C8连锁群上，位点与直径为指标检测到的QTL大致相似，只是加性效应和奉献率略有差别。阐明苗期鉴定的3项指标都能反映油菜对菌核病的抗性。2011年成株期琼脂块接种办法检测到的QTLs4月采用成株期琼脂块鉴定，以接种后7天、10天的病斑长度和的病斑扩展速度为抗性指标进行检测到10个QTLs，分别位于A2、A6、A7、C2C6、C8连锁群，解释的表型变异幅度为2．9l％一41．6％。其中接种后第7为指标检测到3个QTLs，位于A2(SRMll．7-1)、A7(SRMll．7-2)、C6(SRMll．7-3)连锁群上，解释的表型变异分别为3．9896、2．91％和33．13％，位于C6连锁群上的C6SRMll．7C-3位点最大，来自抗性亲本甲7005的抗性等位基因对抗性起增效作用，其它位点对来自抗性亲本的抗性等位基因对抗性起减效作用。接种10天病斑长度为指标检测到5个QTLs，分别位于A2(SRMll．J仉J)、A7个QTL解释的表型变异变幅为3．04％．41．06％，共解释了56．11％的表型变异。其中A2、A7、C6连锁群上的位点与第7天检测的位点重叠，位于C6连锁群上的SRMll．10．4位点最大，来自抗性亲本甲7005的抗性等位基因对抗性起增效作用，并且与年成株期抗性6d、8d以及4-8d病斑扩展速度检测到的位点完全重叠。其它位点来自亲本华双5号的抗性等位基因对抗性起增效作用，苗期抗性鉴定也在C8连锁群上检测到一种QTL位点，但是与10d病斑长度为抗性指标检测到的位点没有重叠区段。接种后7d．10d病斑扩展速度为抗性指标检测到2个QTLs，分别位于(SRMll．7-10-1)和C6(SRMll．7-10-2)连锁群上，单个QTL解释的表型变异为．和32．44％。其中C6连锁群上的位点与7d和1ld病斑长度检测到的位点相似。从上述成果能够看出，甘蓝型油菜抗菌核病在接种早期和接种后期检测到的抗性QTL不尽相似，接种后期寄主植物充足启动本身的防御机制。抗侵入和抗扩展机制也不尽相似，抗侵入重要是病原菌与寄主植物的物理作用，而抗扩展重要是寄主植物体内多个与抗病有关酶基因的体现。这一点与得出的成果吻合。不同年份的成株期鉴定检测到的QTLs和在甘蓝型油菜相似的生育期进行成株期抗性鉴定，2甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL到一种共同的位点，位于C6连锁群上。这一位点涉及6个QTLs，其中3个来自年成株期接种后6d、8d病斑长度和4—8d病斑扩展速度，另外3个来自7d、QTL不同鉴定办法检测到的QTLs2种不同的鉴定办法(苗期离体叶片鉴定和成株期琼脂块鉴定)在两年的实验中检测到共同的2个QTL位点，其中苗期离体叶片鉴定和成株期鉴定在A3和A9连锁群上检测到共同的QTLs，苗期离体叶片鉴定和2011年成株期鉴定各在C8连锁群上检测一种QTL位点，但是没有重叠区段。华中农业大学201l届硕一l：表9复合区间作图法检测出的抗性Table9PutativeQTLsdetectedbyCIMforresistancetoSelerotinia抗性指标QTL|x．问标记加性效心6)InoculationmethodsResistantMarker 8)QTLb’加性效应，正值表达对抗性起增效作用的等位基因来自亲本华双5号，负值表达来源于甲7005引QTLsdesignatedusingthetraitsnameinitialsfollowedbyfewnumbers，numberswereusedtoindieatetheinoculationtime，the．量m．m棚叭锶№舨删mk吼甜m．量m．m棚叭锶№舨删mk吼甜mm嘴 withincreasing华中农业大学2011 一”"似∞阳瞄∞似似∞私勉l}}粥∞∞耵舶 艘嘞一啪啡眺一一嘲眦一一百||§一吣一眺～ 眦}电8伯麓别碰筋嬲嚣l淞积嚣}黜黜l{；镪舶嚣j鼬∞黜黜固鼬盆I儆瞄刀礤BOF葛书 SS陌书 日贷 皓*锄 gg $Sfl站 &Rg 孙由 BBj鳓吣S熟雠耄；；撕抛翻拼研刚姒；拿椰裁 ＆甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL伯搿i；llo

▲— 图7和2种鉴定办法检测到的甘蓝型油菜抗菌核病的Fig．7．Quantitativetraitloci(QTLs)forSclerotiniasclerotiorumresistancewithdetachedleaves(m)andmycelialpluginoculationmethodsinand华中农业大学201l讨表型鉴定的精确与否是影响甘蓝型油菜遗传分析和QTL甘蓝型油菜抗菌核病表型鉴定的真实可靠性影响抗性QTLs的定位。现在对油菜抗菌核病鉴定的程序重要有两大类：室内可控制条件下的苗期鉴定和田间成株期鉴定。在我们的实验中这两大类办法都进行过尝试和比较，多个鉴定办法的优缺点也在综述部分进行了论述。苗期接种鉴定办法重要有：离体叶片鉴定、叶柄鉴定、草酸鉴定、子叶鉴定。Bradly()比较了离体叶片鉴定、叶柄鉴定、草酸鉴定几个苗标sll(sternlesionlength)无法测量，并且另一鉴定指标dw(daytOwilt)并不能区Harsh()成株期的田间接种办法，重要有菌丝琼脂块接种、花瓣接种、带茵牙签接种、青角果火柴棒接种、带菌大麦粒接种等办法。另外，尚有病圃埋菌核鉴定法和田间分生孢子悬浮液喷雾法等。刘胜毅(1999)论，温室病圃鉴定法是一种能够真实反映田间发病状况的办法。但是现在没有大面积的温室病圃供使用，对大量的群体鉴定时难以进行，并且温室病圃发病时对周边环境规定较高，需要均一的温度和湿度条件，环境的控制比较难以实现，对温室的设立要去较高。费维新()采用人工接种鉴定和田间自然发病鉴定的办法，比甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和OTL在本研究中成株期重要采用带菌琼脂块接种法，该办法与苗期离体鉴定都有一个共同点：以琼脂块作为核盘菌生长的介质，为其提供生长所需的能量。琼脂块接种鉴定简便易行，适合大规模的接种鉴定。缺点是在接种在田间进行，不能人为的控制发病时温度和湿度的均一性，受田间自然环境和小气候的影响。并且接种时单个植株的长势也不一致，致使发病和扩展的程度有所差别。在我们的实验中，琼脂块接种鉴定能较好的辨别群体之间的抗病差别。田间自然发病重要是由于核盘菌通过感染了核盘菌子囊孢子的花瓣落在植株茎、叶上来侵染植株，我们能够考虑通过检测被子囊孢子感染的花瓣来拟定病害的发生程度。普通油菜初花期被子囊孢子感染的花瓣较少，而盛花期和终花期被感染的花瓣较多。支较多，菌丝基本上无重叠现象。总而言之，菌丝的活力以及浓度是很难拟定的。甘蓝型油菜抗茵核病的遗传基础和QTL实存在相对抗性较强的品种，抗性变异也是广泛存在的。对三大类油菜的抗病性研由于抗源的缺少，甘蓝型油菜抗菌核病的育种进程缓慢。现在对油菜抗菌核病QTL分子标记定位工作，报道的不多，在前面的综述中已经总结了现在QTL定位的研究工作。在本研究中，我们采用苗期离体叶片接种法和成株期琼脂块接种办法鉴定了QTL华中农业大学201l年成株期2年重复中，有1办法和两年重复中重复检测到，推测这些抗性基因的体现与油菜生育期和组织特异性有关，不同生育期和接种组织部位的差别，都会造成检测位点的不同。由于苗期离体叶片接种反映的是叶片的抗性，而成株期鉴定反映的是茎干的抗性，接种鉴定的时间也有差别，由此能够推断出甘蓝型油菜对菌核病的抗性含有组织特异性和时和成株期琼脂块接种前期(6dpi)和接种后期(8．10dpi)的QTLs不尽相似，并且抗侵入和抗扩展为抗性指标检测到的QTLs者的互作以及环境条件的影响亲密有关。在寄主植物发育的不同阶段、接种的不同时期、不同部位、不同的接种办法都有可能检测到和抗性有关的不同基因。对菌核病的抗性更是如此，之因此这样认为，重要是基于下列2个方面的因素。①核盘菌寄主广泛，可侵染400多个植物物种，是世界范畴内寄主最广泛的真菌病原菌之一，其感染寄主植物的分子机制现在尚不清晰的(Zhao，)。②在向日葵、大豆的抗菌核病研究中，普遍发现存在着复杂的抗性机理。Grezes—Besset(1994)研究向日葵的抗性机制，成果发现在茎杆和花序的抗性鉴定中分别检测到不同的抗性基因，并且未见重复检测到得基因。Mestries(1998)在向日葵抗菌核病QTL定位中，共检测到的甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL6个与抗性有关QTLs，其中4个QTLs是控制叶片的抗性，2个QTLs控制柱头的抗性，只有一种共同的QTL与叶片和柱头的抗性都连锁(这一研究成果与我们抗菌核病的定位成果相似)。从真菌病理学的角度来看，当病原菌入侵寄主植物时，首先碰到的妨碍是来自 穿透钉(penetrationpegs)穿透油菜体表，在不同组织中穿透钉大小没有差别，但是之间以及在细胞壁内扩展(Huang)。而油菜在与核盘菌的协同进化过程中，生华中农业大学2011指标，这样就克服了单运用病斑长度来考察材料抗感病程度的局限性。接种早期只能反映出病原菌与植物表面组织的互相作用这一物理过程，寄主植物表面角质层的厚度和成分会发成细微的变化，此时病斑长度可能只是反映寄主植物表层的变化，利用此时的菌斑长度作为指标考察抗病性并不能全方面的解释植物抗侵入和抗扩展这两个过程。只有当茵丝侵入植物组织后来，才与组织内的抗性有关酶互相作用，寄主体内抗性有关基因体现，此时才体现出寄主植物分子和基因水平的抗性。因此运用病斑扩展速度考察材料抗病性更能真实地反映出菌丝与植物体内的酶互相作用这一生理生化过程。QTL由于数量性状在分离群体中呈现持续分布的特点，对数量性状基因的定位重要采用统计学和遗传学相结合的办法进行。现在惯用的数量性状分析办法有：单标记分析法(ANOVA)、区间作图法(IM)、复合区间作图法(CIM)和完备区间作图法不同的QTL作图办法各具特点。单标记分析法的原理是通过测验不同标记基因型数量性状均值的差别明显性来拟定控制该数量性状的QTL与否与标记连锁，如存在明显差异，则表明可能存在一种与标记相连锁的QTL。由于其不需要构建分子标记连锁图，办法简朴而被广泛使用。区间作图法、复合区间作图法以及完备区间作图法均是建立在完整的分子标记连锁图的基础，通过一维扫描全基因组逐点检测QTL的存在，以两个相邻标记位点间任一位置上存在QTL和不存在QTL的似然函数比值的对数，即(LOD)值的大小及其峰值的存在判断任何一种位点的上存在QTL的可能性(Lander1989)。惠大丰(1997)发现在同一明显水平下，单因子方差即使难以标定QTL的精确位置，但是分析发现QTL的能力可能是最高的，复合区间作图法次之，区间作图法最少，三种办法的同一性仍然是最重要的。间作图法无法精拟定位连锁QTL，而复合区间作图法则无法精拟定位互斥连锁的QTL(李慧慧，)。在本研究中抗菌核病的QTL定位采用复合区间作图法。甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和QTL此难以精确拟定LOD临界值对应的一次检查和全局Q(犯假阳性错误的概率)，但一些非参数统计办法已用于给定全局Q后LOD临界值的拟定。Landerr1989)认为LOD值的大小应使检测到的假阳性的QTL错误率(Q)不超出5％。普通认为采用2-3的临界值能够把全局Q控制在5％以内，在显性QTL和互作QTL作图中，似然比统计量有较大的自由度，还可适宜考虑采用较高的临界值，如3—4。采用较高的LOD值能够更加好地控制假QTL的发生，同时遗传效应较小的真QTL却不易被检测出来(李慧)。在以往的作图研究中，针对不同的作图群体和研究的性状，还没有固定的LOD取值。在本实验中，取LOD值为2．5作为QTL存在可能性的临界值。由于本研究目的是通过对数量性状的定位来增加对菌核病抗病性状的选择和标记的辅助选择的有效性，效应小的QTL同样重要。因此在QTL的初级定位研究中，取不太严谨的LOD值作为检测含有较小效应QTL的定位参数亦是可取的(1)现在植物抗菌核病的分子和生化水平的抗性机理尚不明确，DH群体的成株期抗性如何，与否能真实的反映田间自然抗病反映?苗期抗性和成株期抗性与否存在有关性以及存在何种关系?其抗病特性与否真实的存在组织和时间体现的差别性?检测到的抗性QTL有无差别?哪些抗性QTL是构成型体现的?哪些抗性QTL是油菜发育时期特异体现的?哪些是受核盘茵诱导体现?以及这些QTL定位信息是如何的?都需要做进一步研究。(2)菌核病的发生重要在油菜生育后期的成株期，例如盛花期、终花期和青角果期，因此，研究此发育时期的抗病特性更为重要，但是，如何优化前人发明的成株期接种的弊端，如何找到适宜精确的接种办法，是首要考虑的问题。(3)将本次检测到的抗性有关QTL，特别是那些与前人定位研究中重复检测到得QTL进行序列对比和功效分析，即运用左右相近的标记序列直接从基因组中分离目的片断，对这些片断进行生物信息学分析，对比前人研究的目的片段，以找到稳定体现的QTL，并将其应用(4)将本次定位到的那些对表型奉献率较大的抗性QTL在次级作图群体中进行精细定位，然后将这些功效片断分离克隆直至将抗菌核病有关基因分离、克隆以致应用。(5)研究不同接种时间，不同接种部位，抗病有关基因的体现变化，结合本研究得到的抗性有关QTL定位成果做进一步基因体现谱分析，以揭示甘蓝型油菜与核盘菌互相作用的分子机理，为下一步的研究拟定候选基因。华中农业大学201l1993，2：4—费维新，李强生，陈风祥，等．14护科学，，23(1)：254-甘蓝型油菜抗(耐)菌核病的遗传分析和OWL李强生，胡宝成，HA 科学Rimer，S．R．农业科学，，37(14)：6378--伊向锐．甘蓝型油菜抗菌核病0TL学张洁夫，陈玉卿，伍贻美，等．油菜种质资源抗(耐)茵核病性筛选与鉴定．江苏农业科学，1994，(2)：26-28，24(3)：6—Bailey,DJ．ScreeningforresistancetoSclerotiniasclerotioruminoilseedrapeusingdetachedleaves．TestsAgrochem．Cult，1987，8：15