北大医学研究生课程-分子免疫学-程序性细胞死亡-陈玉英教授

陈英玉

CellLifeCellDeath“Lifecannotexistwithoutdeath〞withoutcelldeath,an80-year-oldpersonwouldhave2tonsofbonemarrowandlymphnodes,andagut16kmlong(Nature,412:23,2001)

ApoptosisNecrosis-like

AutophagyParaptosisOncosisPragrammedCellDeathPCDMitoticcatastropheentosisAnoikisSectionⅠApoptosis

(Type-ⅠPragrammedCellDeath)ApoptosisandDiseases1090–131=959(cells)研究历程ProcessofApoptosisApoptosisTRAIL/TRAIL-RFasL/FasTNFR1/TNF-

ChemicalsUV,stressprocaspase3Activecaspase3ERpathwayRegulationofApoptosis特点多样性耦联性统一性

多途径CaspaseActivationinapoptosisCaspase种类：18种1细胞因子的加工和成熟相关：Caspase1,4,5,11,13,12,14,15,162启动性Caspase:Caspase2,8,9,10,183效应性Caspase:Caspase3,6,7，17Caspase的结构特点Caspases具有相似的氨基酸序列、三维结构和底物特异性，都以无活性的酶原形式(procaspase)表达。Caspase酶原〔pro-Caspase〕分子含有三个结构域：N端结构域、大亚基〔～20KD〕和小亚基〔～10KD〕。酶原经结构域间的肽链水解，别离出大、小亚基并结合成二聚体，再与另一个二聚体形成四聚体，获得Caspase蛋白水解酶活性。酶原的水解位点是Asp，且本身就是Caspase的靶序列。Schematicrepresentationofthehumancaspasesdepictingtheirstructureandproposedfunction酶活性位点ProdomainLargesubunitSmallsubunitAspAspProcaspase3〔～20kD〕〔～10kD〕活化Caspase3多变性CaspaseSubstratesMitochondriaandApoptosis

线粒体是细胞凋亡调控中心Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中起着至关重要的调节作用Bcl-2familyproteinsinapoptosisBcl-2家族蛋白种类：30余种1抗凋亡蛋白：包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1、Boo和Ced-9等2促凋亡蛋白：包括Bax、Bak、Bcl-Xs、Bcl-rambo等3BH3-only促凋亡蛋白，包括Bid、Bad、Bim、Bik/Nbk、Hrk/DP5、BNIP3、EGL-1、Noxa、Bmf、PUMA/Bbc3等Bcl-2家族的大局部抗凋亡蛋白一般作为膜整合蛋白插入到线粒体外膜上，而促凋亡蛋白那么以非活性的形式分布于胞质中或细胞质骨架上。当细胞受到死亡信号刺激后，促凋亡蛋白便从胞质中转位到细胞器的膜结构上，尤其是线粒体外膜上，引起细胞器功能丧失和各种促凋亡因子包括线粒体细胞色素C、凋亡诱导因子〔AIF〕、Smac/Diablo等的释放，经凋亡信号的逐步放大，最终导致细胞凋亡。

StructureofBcl-2familyProteinBH4BH2BH1BH3BH3BH2BH1BH3BH3结构域是促凋亡蛋白必需的致死结构域，也是Bcl-2蛋白家族成员之间相互作用及促凋亡活性极为重要的关键性结构。一、形态学检测光学显微镜，荧光显微镜，共聚焦显微镜，电镜二、磷脂酰丝氨酸外翻分析〔AnnexinV法〕FCM分析，荧光显微镜，共聚焦显微镜，三、Caspase活性的检测WesternBlot,荧光分光光度计分析Caspase3、8、9的活性分析四、细胞周期的检测FCM分析亚二倍体细胞以及各周期变化五、DNA片断化检测TUNEL实验，DNAladder六、线粒体功能的检测膜电位，细胞色素C释放,BCL-2家族蛋白检测等七、其它细胞凋亡的检测方法〔主要介绍基因中心的研究成果〕一细胞凋亡的形态学检测1光学显微镜和倒置显微镜2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜3电子显微镜4流式细胞计分析1光学显微镜和倒置显微镜〔1〕未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。〔2〕染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围，凋亡晚期核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。1光学显微镜MockTMEM166BaxTMEM166inducescelldeath—293T，36hoursWangL,etal.APOPTOSIS,2007,12:1489–1502Chromosomecondensation,cellbodyshrink2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPIDAPI用于固定渗透化的细胞HO33342用于活细胞的染色TMEM166inducescellapoptosispcDBTMEM166Bax

DAPIstaining—293T结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩,边缘化。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3电子显微镜观察pcDBBaxTMEM166 HeLacellsapoptosisinducedbyTMEM166andBaxoverexpression电子显微镜观察4Morphology---ShrinkageofCellsFACSanalysisJurkatcellapoptosisinducedbyTRAIL凋亡细胞位置左移ApoptoticcellsUntreatedTRAILtreated二、磷脂酰丝氨酸〔PS〕外翻分析〔AnnexinV法〕

磷脂酰丝氨酸〔Phosphatidylserine,PS〕正常位于细胞膜的内侧，但在凋亡时，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外表，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素〔FITC、R-PE〕或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。apoptosisExternalizationofPSCa+Ca+Ca+Ca+PSFACSanalysisFITC-Annexin-V-FluorescenceMCF-7cellapoptosisinducedbyTRAIL-170

------dosedependentmannerPIFluorescenceTMEM166inducesapoptosisFACSHeLacellsapoptosisinducedbyTMEM166andBaxoverexpressionOverexpressionofPDCD5promotes293cellapoptosisinducedbyserumwithdrawal

PDCD5是凋亡的促进分子mockPDCD57.5ug/mlPDCD515ug/mlPDCD530ug/mlIDR56ng/mlIDR56ng/ml+PDCD57.5ug/mlIDR56ng/ml+PDCD515ug/mlIDR56ng/ml+PDCD530ug/mlRecombinanthumanPDCD5couldpromotetheapoptosisofK562cellsinducedbyIdarubicinfor24hours

7.29%7.88%7.94%22.57%25.11%29.87%37.86%7.91%ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI三、Caspase活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用。其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原〔32KD〕的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活性形式的Caspase-3由两个大亚基〔17KD〕和两个小亚基〔12KD〕组成，裂解相应的胞浆胞核底物(如PARP、lamin等〕。方法1.Westernblot分析2.荧光分光光度计分析

3.caspase抑制剂的应用Westernblotanalysisofcaspase-3,PARPduringTRAILinducedJurkatcellapoptosisActivationofCaspase-3CleavageofPARPResultsofWesternBlot荧光分光光度计或光谱分析

原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质或pNA(p—Nitroaniline,p-硝酸酯〕偶联的短肽Ac-DEVD-AMC或Ac-DEVD-pNA。在共价偶联时，AMC或pNA不能被激发荧光或显色，短肽被水解后释放AMC或pNA，自由的AMC或pNA才能被激发发射荧光或显色。根据释放的AMC荧光强度的大小以及pNA显色的深度，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。Ac-DEVD-AMC的敏感性高于Ac-DEVD-pNA酶活性位点ProdomainLargesubunitSmallsubunitAspAspCaspase3酶原〔～20kD〕〔～10kD〕活化Caspase3Ac-DEVD-AMCAMCAc-DEVD-pNApNACaspaseactivityAssayInductionofapoptosis

Proteaseactivation

CelllysatepreparationCaspase-3Caspase-8Caspase-9DEVD-AMCorpNAIETD-AMCorpNALEHD-AMCorpNAAMCorpNAAMCorpNAAMCorpNAPOLARSTARorELISAReader405caspase-3activityinHeLacellstreated

withTMEM166andmeasuredbyPOLARstar3CASPASE抑制剂的应用

鉴定凋亡诱导基因或促凋亡基因是caspase依赖？caspase非依赖？两者都有？

z-VAD-fmkcaspaseinhibitorz-DEVD-fmkcaspase3inhibitorz-IETD-fmkcaspase8inhibitorz-LEHD-fmkcaspase9inhibitor

Z-ATAD-fmkcaspase12inhibitor

z-VAD-fmkpartiallyblockedtheIM9/Bcl-2cellapoptosisinducedbygossypolPan-caspaseinhibitorInhibitioneffectsofz-VAD-fmkonJurkatcellapoptosisinducedbyTRAIL170.Jurkatcellswerepre-incubatedwith50

mofz-VAD-fmkfor1h,andtreatedwithsTRAIL-170indifferenttime,thenstainedwithFITC-AnnexinV+PIandanalyzedbyFlowcytometry.Resultsshownthatz-VAD-fmkcaninhibitJurkatcellapoptosisinducedbysTRAIL-170.inhibitionTMEM166inducesapoptosisz-VAD-fmkpartiallyblockedtheHeLacellapoptosisinducedbyTMEM166四、细胞周期分析

流式细胞计分析

0h12h24h36h48hAnalysisofcellcycleinIM9cellstreatedwithetopside.Cellsweretreatedwithetopside(20

M)fordifferenttimeandthenfixedandstainedwithPI.SampleswereanalyzedbyFlowcytometry.Percentagesofsub-G1areshownDNAFragmentation---Hypodiploid五DNA片断化检测

1琼脂糖电泳(DNAladder)2TUNEL法方法

在细胞核内，DNA与组蛋白结合形成核小体，然后形成松散的染色质，超螺旋后形成致密的染色体。在细胞凋亡后期，活化的核酸酶以核小体为单位剪切染色体，形成许多长度为200bp倍数的DNA片断，在凝胶电泳中显示为DNA梯度。是细胞凋亡后期确实切证据和检测指标。1DNAladder的检测GelelectrophoresisanalysisofDNAfromTF-1cellsafterGM-CSFdeprivationNote:lane1,2,3,4,5,6,7:Representativesof0,4,8,16,24,36,48hsafterGM-CSFdeprivation,respectively细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3‘-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶〔TdT〕的作用下，将dUTP和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测。。TUNEL方法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中别离的细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。2原位TUNEL方法〔Terminal-deoxynucleotidyltransferasemediated-dUTPNickEndLabeling〕脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记DNAFragmentation---insituTUNEL重组PDCD5促进骨肉瘤细胞凋亡ChenC,etalApoptosis,2021,15:805–813六、线粒体介导凋亡的检测

1mt的检测2ROS的检测3WesternBlot细胞色素C的转位、BCL-2家族蛋白的变化〔BCL-2,BCL-XL,BAX,BAK,PUMA,tBid等)1线粒体膜势能〔mt〕的检测

线粒体荧光染料：Rhodamine123、DiOC6〔3〕、JC-1、等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。本卷须知1.始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。2.与染料到达平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与局部染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。3.染色后的细胞检测前一定放在冰浴中!!OverexpressionofTMEM166causesthedecreaseofmitochondriamembranepotentialinHeLacellline活性氧对细胞凋亡的调控是通过线粒体膜透过性转运孔而起作用。氧化应激可影响线粒体PTP的开放与关闭，线粒体ROS产生增多可以引起线粒体PTP开放。PTP的开放会引起线粒体膜电位下降，线粒体肿胀和细胞色素C释放，继而引发细胞凋亡。

2细胞内ROS的检测试剂CM-H2DCFDA,Mw=535.8 溶剂:无水乙醇或DMSO储存液：0.5mM原理

CM-H2DCFDA进入细胞后，被酯酶切割，从而被trapping在细胞中。此染料本身是不发光的，在细胞中被自由基氧化成可发光的物质，因此，可用此染料测定细胞内的自由基水平〔详见MolecularProbes网页或指南〕。FCM分析细胞内ROS的水平WesternBlot

细胞色素C的转位

BCL-2家族蛋白的变化

BCL-2,BCL-XL表达下调？

BAX表达上调？转位？

BidtBid

BAK,PUMA等表达上调？WesternblotanalyzethereleaseofcytochromecfromMitochondriainSW1353cellsinducedbyrhPDCD5proteinandcisplatinChenC,etalApoptosis,2021,15:805–813rhPDCD5proteinincreasescisplatin-inducedthereleaseofcytochromecinSW1353cellsrhPDCD5proteinincreasescisplatin-inducedpro-apoptosismoleculeexpression,decreasespro-survivalmoleculeexpressioninSW1353cells

ChenC,etalApoptosis,2021,15:805–813六其他死亡受体〔Fas，TNFR等〕凋亡抑制蛋白的检测〔XIAP等〕信号转导通路中的蛋白磷酸化或去磷酸化的检测〔磷酸化抗体，如p38,ERK等的检测〕细胞内Ca流〔Fluo-3〕的检测几种相对定量的实验方法

MTT,CCK-8或H3掺入细胞生长曲线

克隆形成实验克隆形成实验MockBAXCaspase非依赖的PCD

AautophagyParaptosisOncosisMitoticcatastropheOthers?

SectionⅡAutophagy

(Type-ⅡPragrammedCellDeath)〔一〕概述1962年，Ashford和Porten发现在饥饿或激素等因素的刺激下，细胞中存在“Self－eating〞现象，并将其命名为“Autophagy〞。目前至少鉴定了33种参与酵母autophagy的特异性自噬基因。其命名从最初称的APG，AUT和CVT，统一命名为自噬基因ATG(AuTophaGy-specificgene,2003年).哺乳动物自噬基因至少鉴定了18种，其命名与酵母有个别差异酵母的ATG8在哺乳动物称为LC3，酵母的ATG6在哺乳动物那么称为Beclin-1。

全新的国际性杂志<<Autophagy>>已在2005年4月份出版。第一次国际性会议于同年在意大利召开。Autophagy的研究是生命科学领域的一个新的研究热点。细胞自噬是生命科学的前沿方向Medline检索至2021年9月12日有6059篇文献。ATGgenesinYeastMammalian

ATGautophagygnensATG17(FIP200)ATG18(WIPI-1)ATG101〔二〕Autophagyprocess〔三〕Autophagy的分类1大自噬〔Macroautophagy〕2微自噬〔Microautophagy〕3分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediatedautophagy，CMA)CMA降解途径在去除蛋白质时有选择性。CMA的底物都是可溶性的蛋白分子，含有一个HSC70识别的5肽基序－KFERQ－〔四〕自噬体形成的主要蛋白分子1

哺乳动物细胞两个泛素样蛋白系统〔1〕ATG12-ATG5系统，由ATG3、ATG5、ATG7、ATG10和ATG12、ATG16L组成。〔2〕由ATG4、LC3〔Microtubule-associatedprotein1lightchain3,MAP1-LC3〕、ATG3、ATG7蛋白组成。2ClassⅢPI3K、Beclin-1、ATG14形成复合物参与自噬体的形成。3其它TMEM166,TMEM74，TM9SF1

LC3ATG4TMEM166TMEM74TM9SF1ATG9-ATG13-ATG101-ATG17ATG14〔五〕regulationofautophagy1mTOR〔MammalianTargetofRapamycin〕信号途径TOR激酶在自噬的发生过程中起抑制作用，是自噬的负性调控分子，并发挥“门卫〔gatekeeper〕〞作用。2ClassⅠPI3K/AKT(PKB)途径ClassⅠPI3K酶是自噬的负性调节分子3ClassIIIPI3Kinase:是自噬的正调节分子4结节性硬化复合物1〔TSC1〕和TSC2蛋白位于ClassⅠPI3K/PKB途径的下游，抑制TOR激酶的活性，是自噬的正向调节分子。PTEN磷酸酶也是自噬的正向调节分子，可解除ClassⅠPI3K/PKB途径对自噬的抑制。5RAS-RAF-1-MEK-ERK1/26Bcl-2:自噬的负性调节分子7P53：正或负调节自噬其它：胰岛素可抑制自噬，而胰高血糖素促进之

Autophagyregulation〔六〕RolesofAutophagy细胞的新陈代谢涉及蛋白质的合成与降解以及细胞器的更新，而细胞对这种合成与降解的精细调节，对于维持细胞的自身稳定有着重要意义。1自噬是细胞在营养缺陷情况下的一种适应性反响，其降解产物氨基酸等为细胞的生物合成提供了原料。2自噬作为细胞保持稳定状态的管家机制，对长寿命蛋白的调控、过氧化物体和线粒体的更新以及内质网大小的改变起重要作用。3自噬还与某些组织的特异性能有关，如它参与外表活性剂的生物合成，参与红细胞成熟过程中线粒体等细胞器与核糖体的去除等。1Autophagyincellmetabolism2AutophagyandApoptosis1.自噬为凋亡所需,自噬通常先于凋亡，进而启动凋亡，对于凋亡而言，自噬通常是不可缺少的。TNF-可诱导急性T淋巴细胞白血病细胞发生凋亡和自噬，且自噬早于核片段化的出现，并且在凋亡的任何形态学信号出现之前就能观察到自噬体，说明自噬的发生早于凋亡。2.自噬抑制凋亡保护细胞各种因素能够引起线粒体PTP开放，释放细胞色素C等促凋亡因子。在此情况下，细胞可启动自噬来消除受损的线粒体，从而限制了这些去极化了的线粒体释放凋亡因子。但当自噬能力缺乏或损伤严重时，线粒体释放的促凋亡因子将激活凋亡程序。3.自噬与凋亡共同促进细胞死亡细胞自噬和细胞凋亡在一些环境下可能相互转化自噬和凋亡存在很大局部的重叠，它们在同种组织中可同时发生，也可在相互诱导下先后出现。Aschematicmodelillustratingthecrosstalkbetweenapoptosis(red)andautophagy(green)inmammalsshowingthemajorplayersofeachpathwaythathavebeenshowntoalsodirectlyinfluencetheotherone.Someproteinsnegativelycontrollingoneorbothpathwaysarealsoincluded(Blue〕AutophagyandApoptosisTMEM166inducestypeIandtypeIIPCDinHeLacellspcDBBaxTMEM166TMEM166TMEM166TMEM1663AutophagyinCancer自噬对肿瘤的双重作用1自噬对肿瘤增殖的抑制作用研究发现，肿瘤细胞系中自噬作用的水平低于正常细胞。现在发现有些抗肿瘤药物的作用机制之一，就是激发肿瘤细胞原本低水平的自噬效应，尤其是凋亡缺陷的肿瘤细胞。如Rapamycin.肿瘤生长的早期阶段自噬增强，抑制肿瘤。肿瘤进入开展阶段后基因变异积累，使包括Beclin在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。2自噬对肿瘤细胞的保护作用自噬具有保护肿瘤细胞的作用。肿瘤生长的后期，在肿瘤中央缺血区域癌细胞处于营养缺乏和低氧的环境，自噬增强。其可通过降解胞内蛋白质及细胞器为肿瘤细胞的生长提供营养及能量，以利于肿瘤细胞在低血管化的环境中生长。还可以保护癌细胞免受药物的攻击。

自噬在不同肿瘤或同一肿瘤的不同阶段发挥不同的作用Yueetal.,PNAS,2003

ChemotherapeuticagentsthatinduceautophagyDrugsTargetidentifiedImatinibBcr-AblTemsirolimusmTORC1EverolimusmTORC1PerhexilinemTORC1NiclosamidemTORC1AmiodaronemTORC1RottlerinmTORC1CurcuminmTORC1EB1089(vitaminD)CamKKArsenictrioxideBNIP3/Beclin1AICARAMPKMetforminAMPKPerifosineAktGSK69O693AktTriciribineAktCurrentOpinioninCellBiology2021,22:246–2514Autophagyinneurodegenerativediseases帕金森病〔PD〕家族性的PD发生与患者synuclein蛋白发生突变有关。亨廷顿氏舞蹈病〔HD〕HD的病理变化与亨廷顿蛋白〔Huntingtin〕发生突变以及突变蛋白在细胞内的过度蓄积有关。自噬好似一把双刃剑，一方面，自噬作用参与异常蛋白质的降解，防止神经元内异常蛋白质的蓄积，另一方面，自噬作用过度会损伤细胞器，如造成线粒体功能障碍，从而引起细胞死亡，过度的自噬作用可能参与了神经退行性疾病的发病过程。

细胞自噬参与维护神经系统的正常功能Komatsuetal.,Nature,20065AutophagyinImmunity

IRG,immunityrelatedGTPases;PAMP,pathogenassociatedmolecularpatterns;PRR,patternrecognitionreceptors;TLR,Toll-likereceptorsAutophagyinMHCclassIIantigenprocessingTh1andTh2cytokinesactivateandinhibitautophagyNedjicetal.,Nature,2021〔七〕AutophagyDetection一〕形态学方法1电子显微镜：检测autophagosomes2Monodansylcadaverine(MDC)染色二〕Autophagy的特异标志物检测1LC3-II含量增多,LC3-II/LC3-I比例的升高:westernblot2内源性斑点状LC3增多：