转基因动植物课件

转基因(transgenic)动植物就是用基因工程的方法将人们需要的外源目的基因导入动、植物体内，整合到动、植物的染色体上，与内源基因在一起，随细胞的分裂而复制，在生物体内得到表达，并能稳定地遗传。整合到动植物基因组上的外来结构基因称为转基因(transgene)，由转基因的蛋白质称为转基因产物，通过转基因产物影响动物性状。

第七章转基因动植物1转基因将涉及到人类的基因治疗、转基因食品、体细胞克隆、以及农业、畜牧业和药物、食品工业的微生物育种和生物制药的发生器等。其目的无非是治疗遗传病，改良动植物品种，提高食品的营养价值和生产更好更廉价的药物，提高人类的生活质量。2

用基因工程技术来产生四类转基因生物:①科学家们用P因子转化果蝇，来研究胚胎发育；②通过转染和生物射弹（biolistics）对植物进行DNA转染；③制备人类疾病的动物模型；④产生转基因家畜。其他两种转基因模型生物是线虫（C.elegans）和小型热带鱼类—斑马鱼(Daniorerio)。3第一节

果蝇发育的分子生物学分子克隆技术一开始一些遗传学者就制备了一系列果蝇的突变品系，他们利用这些突变体在果蝇基因组中对特定基因进行物理定位。先用RNA印迹来研究基因表达，并用原位分子杂交来进行定位。直到将克隆DNA插入到果蝇的生殖细胞中人们才能开始了解发育过程是怎样控制的。

4

一、P因子介导的转化转座因子含有两个功能区：（1）转座因子两端的DNA重复序列，此是整合和切离所需要的；（2）编码转座酶的DNA序列，此是转座所需要的。

A.Spradling

和G.Rubin根据在其他系统中转座因子的研究，论述了克隆的P因子序列可用于构建果蝇的表达载体，诱导克隆的DNA的“终末”转座到果蝇的生殖细胞中。他们使用的技术是用鉴别转座基因的标记基因和待测定的实验基因取代克隆P因子中的转座酶编码序列。5基因调节区转座酶雌蝇雄蝇收集受精卵将质粒DNA直接微注射入卵中10天(a)P因子转座是用纯化的质粒DNA共注射果蝇的胚胎，使其整合到生殖系DNA中的方法。P因子转化质粒上的标记基因是一种编码眼色素的序列。它可通过玫瑰红眼(ry+)用来鉴别转基因，相反，未转化的果蝇是白色眼(ry-)。G0G1

CAATSP1AP16G4(a)在这个例子中，调节区插在表达的发育基因（ry+）5'端lacZ报导基因的上游。带有玫瑰红（ry+）眼的第二代雌蝇(G1)中每个细胞都含有P因子，并可用来控制lacZ报导基因在早期胚中的表达。鉴别带有单个P因子插入的果蝇，与G1果蝇回交产生纯合的同基因品系。正如例中所示，在早期胚中，内源靶基因的蛋白质表达模式和lacZ

报导基因相同，表明克隆的靶基因调节区是完全有功能的。7在转入lacZ基因的雌蝇和缺陷型雄蝇(不能产生早期胚发育所需的转录因子)之间进行杂交，能用来测定转录因子控制的靶基因的特异性表达8

二、P因子增强子阱载体

增强子阱(enhancertrap)是将某报导基因与一个最小化的启动子相偶连，组成一增强子阱重组体，即该启动子能够与转录因子结合但活性很低，而需由被插入的增强子帮助才可正常转录。如果增强子捕获重组体整合进增强子的作用区域，那么启动子的活性就会激增，使报导基因得到充分表达，则可推知插入位点附近有增强子存在，即以该增强子阱重组体来探测增强子是否的目的。910品系1品系2产生独立的Gal4增强子捕获品系弱启动子区转座酶11品系1品系2Gal4结合位点Gal4待测品系

翅特异增强子阱

腹部特异增强子阱12

Gal4

增强子阱方法是用通过筛选转基因果蝇来鉴别细胞特异增强子，这些果蝇表现出Gal4控制的

IacZ基因的有限表达

。在此例中，

品系1

在翅膀特异基因附近插入了Gal4

增强子阱；品系2在腹部体节基因中插入了一个转录的调节区。鉴别细胞特异增强子阱果蝇品系对于研究靶基因表达调节异常是有用的方法。

Gal4

增强子捕获的插入通过破坏基因能导致表型突变，通过重新获得Gal4基因邻近的基因组序列提供了一种鉴别发育基因的方法。13三、可介导转化的其他真核转座因子

（一）、水手因子(marinerelement)

水手因子是由H.M.Robertson于1993年从果蝇中鉴别出的转座因子，并发现存在于多种昆虫中。水手因子末端为28bp的反向重复序列。中间是编码含有345aa的转座酶。14（二）、睡美人（SleepingBeauty，SB）

SB是水手转座因子超家族中的一员，长1.6kb,两侧是231bp的IR。中央区编码一个转座酶和DNA识别区。它能够将自己插入到基因或基因之间，活化或关闭一个基因的正常功能。实验证明，SB能将外源基因插入到脊椎动物培养细胞中，包括小鼠的胚胎干细胞及人类细胞。

转座因子睡美人的结构特点15（三）、PB(piggyback

)因子

PB因子(PBelement)属于真核生物的第二类转座子，“PB”是“piggyback(卡车拖车)”的缩写。其来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia)，是一个自主因子，长2.5kb，两端有长为13bp短的反向重复序列（IR），另外还存在不对称地分布的内部反向重复序列(19bp)，中央区有一个长2.1kb可读框，编码转座酶。16

2005年TianXu（许田）等成功改造了来源于飞蛾的PB因子并将其应用于哺乳动物。PB可在人和小鼠细胞株中高效导入基因并稳定表达，为体细胞遗传学研究和基因表达提供了一个高效、便捷的新系统。17Dr.XuisalsoprofessorandvicechairmanofgeneticsatYaleSchoolofMedicine,directoroftheMouseFunctionalGenomeProject,andadjunctprofessoranddirectoroftheFudan-YaleBiomedicalResearchCenteratFudanUniversity.TianXu,PhD

181920

第二节

构建转基因的农作物

提高农作物质量和产量的有两方法。一是杂交育种，但不可能将所有的优良性状组合到一种植物中。二是用杀虫剂和除草剂。长期使用化学药物会导致环境的破坏。而用转基因的方法能克服以上的问题。达到增加产量，改进质量并可抗病虫害以及抗干旱、盐碱等。有两种产生转基因农作物的常用方法：（1）通过根癌农杆菌的Ti质粒转化双子叶植物；（2）用基因抢等装置发出高速粒子轰击单子叶植物等

。21

植物细胞转染方法(吸收裸露的DNA)聚乙二醇(PEG)

原生质体融合或在Ca2+离子和聚乙二醇存在的情况下直接吸收DNA。在植物中，需要从原生质球/原生质体中重新产生细胞，虽有效，但费力。脂质体转染法

DNA与阳离子脂质体形成复合物，被内吞吸收。是植物原生质球/原生质体的高效方法。电穿孔通过高电压短暂冲击产生瞬时小孔吸收裸露的DNA。是转染酵母、植物和动物细胞非常有效的方法。22

微弹(生物弹)

以钨或金的颗粒包被DNA，用基因枪(genegun)高速打入细胞(原先是改进的短枪，但近来发展了用空气或放电的高压冲击波更精制的装置)。不需要去除细胞壁，能对植物细胞有效转染。也能用于转染整个植物组织。接合方法(DNA通过细菌接合转移到真核细胞中)

Ti载体用根癌农杆菌的Ti质粒切得的T-DNA转化培养的活体植物和植物细胞。重组的T-DNA是高效的基因转移载体，尽管只有双子叶植物能被转化。23一、根癌农杆菌介导的基因转移

根农癌杆菌可在植物的创伤处产生冠瘿瘤（crowngalltumors），通过此可鉴别根农癌杆菌的感染。根农癌杆菌最好的品系是A.tumefaciens，通过转移机制它可以传输25kb左右的DNA，进入到植物细胞中。此短片段DNA称为转移DNA（transferDNA,T-DNA），即Ti质粒中可转入植物基因组的DNA片段。这类似于细菌的接合（conjugation），植物组织创伤区域释放的植物激素的刺激导致了接合的产生。24Ti质粒有四个保守区

Ti质粒（Ti-plasmid）为长200kb左右的单拷贝A.tumefaciens

质粒，有4个主要的功能域：（1）T-DNA：携带植物激素基因和章鱼碱基因；（2）vir区域：侵入性基因（virulencegenes）（3）接合基因：和质粒转移有关（4）冠缨碱利用。25T-DNA冠瘿碱合成基因vir致瘤oriTi质粒冠瘿碱代谢基因细胞分裂素基因生长激素基因RHLH200kbTi(tumour-induced)质粒，根据不同株系，其大小变化在5-450kbp之间。有两类Ti质粒，分别诱导产生不同的冠缨碱，章鱼碱(octapines)或胭脂碱(nopalines)。Ti质粒一般都有四个保守区域：（1）T-DNA，携带植物激素基因和章鱼碱基因；（2）是毒性基因vir(virulence)区域。（3）携带接合基因，与细菌间质粒的转移有关。（4）编码功能与冠缨碱利用有关。26天然的Ti质粒不能使用。（1）可产生肿瘤。可采用破坏或删除肿瘤基因来解决。（2）太大，不便操作。可用两种策略来解决：

a.将T-DNA克隆到中间载体上操作后再导入根癌农杆菌中，与内源性Ti质粒重组。

b.将T-DNA和vir基因分别克隆在两个小质粒上。27冠瘿瘤28中间载体消除的Ti质粒Ti质粒消除的Ti质粒共合体质粒转基因植物的染色体(a)重组消除转化29烟草植物细胞转基因细胞细胞培养移植转转基因植物转转基因植物细胞转基因细胞(a)为了产生转基因植物，中间载体的大小以易于克隆插入片段为宜。中间载体与消除的Ti质粒重组而产生的共合体结构，此质粒在边界间插入了一个可选择的卡那霉素抗性标记。(b)通过T-DNA转化细胞的生长产生转基因植物。30vir区控制T-DNA转移的过程。

vir区有virA和virG两个基因。virG编码对受伤植物释放的酚类化合物作出应答的调节因子。virA编码受配基刺激自身磷酸化的受体，并将磷酸基转移给VirG。VirG是vir基因座上的转录因子，可诱导vir下游基因

virD1,virD2和virE2基因转录。

virD1,virD2合成内切酶。

T-DNA序列的两侧有两个25bp长的短重复序列元件，称为T-DNA的右边界（rightborder，RB）序列和左边界（leftborder，LB）序列。31

在T-DNA转移的过程中，VirD1,

VirD2蛋白能识别RB和LB序列。

超驱动序列(overdrive)是邻近右手边界的序列，它通过与VirC蛋白特异的相互作用，指导内切酶到达边界序列，促进

T-DNA边界序列的缺口剪切，从而增强

T-DNA的转移。32

在T-DNA转移的过程中，VirD1,VirD2蛋白能识别RB和LB序列。

超驱动序列(overdrive)是邻近右手边界序列，它通过与VirC蛋白的特异相互作用，指导内切酶到达边界序列，促进

T-DNA边界序列的缺口剪切，从而增强T-DNA的转移。33T-DNATi质粒DNAVirD1/2内切酶virtraVirE2与DNA结合(核定位信号)

植物DNA植物细胞核RHLH精密的RH边界可变的LH边界VirGPPVirA酚类化合物RHLHVirD1/2VirE2

34重组体T-DNA质粒载体除了LB和RB以外，还含有一些功能单位：①宿主的复制区ori；②可供在细菌中选择的抗性标记，如卡那霉素抗性基因(kanr)等；③在LB和RB之间的多克隆位点(MCS)，供外源基因插入；④带有植物显性选择标记基因的启动子，供选择再生植物之用。35通过电穿孔T-DNA载体进入农杆菌中并选择tetr农杆菌转染损伤的植物细胞T-DNA载体根癌农杆菌Ti质粒36T-DNA整合到宿主植物细胞的基因组中Ti质粒基因产物诱导植物再生并选择Kanr细胞生长37

二、用基因抢制备转基因水稻和玉米

大多数粮食作物都是单子叶植物，如水稻、小麦、玉米等。除少数之外，单子叶植物是抗根癌农杆菌转化的，由于在双子叶植物和单子叶植物之间对于创伤的应答反应和产生的激素存在着差异。因此，对于单子叶植物的DNA转染方法最初是用DNA微注射和电穿孔来处理原生质体（protoplasts）。由于原生质体的再生能力弱，严重地影响了转化效率。为了解决这个问题，JohnSanford

建立了一种名为“基因枪法”的单子叶植物转基因的方法。

38生物射弹（biolistics）或称基因枪

(genegun)法,

这些用爆发力转染染方法其效率是不受细胞类型的限制。这种DNA转染法是用金属钨包被DNA片段，制备成微弹通过22mm口径的枪直接发射来轰击完整植物的分生组织区。

3940香港中文大学生物系辛世文教授与研究人员員利用基因枪进行转基因实验4142

图表示两种生物射弹装置。

(a)表示生物射弹装置系统。样本仓直接放置待转基因的植物秧苗，微弹由金属钨或金制成，内包有靶基因DNA，微弹射入样本仓中的隔筛时，这种粒子从微载体中释放出。气体基因枪以压缩气体（氦或氮）转换成的气体冲击波为动力。生物射弹装置系统有一个产生冲击波的特殊结构，让微弹穿越，射入在轰击室底部的靶细胞中。

(b)是手提式基因枪，通过调整He脉冲将包被

DNA或RNA的金粉“子弹”从小塑料管的内壁直接推进到靶细胞中。43用基因枪将带有报告基GUS(细菌中的β－葡糖醛酸酶基因)的外源DNA射入胡萝卜组织中(兰色部分)。44第三节．转基因小鼠一、用受精卵细胞制备转基因小鼠两种转基因方法，建立小鼠模型来研究人类疾病。第一种转基因的方法是将外源DNA微注射到单个的胚细胞中，产生含有一到多个随机插入表达载体的转基因小鼠。第二种方法是在小鼠的基因组特定基因座上通过同源重组取代某些特定的DNA序列。这两种方法建立于1900年代，AbbieLathrop发现这种方法对于繁育宠物鼠是有利的。45显微注射DNA的方法可分两步进行。首先是使雌鼠在预先确定的时间超数排卵，通过和种雄鼠交配，产生大量的刚刚受精的单细胞胚胎。第二步是用手术收集单细胞胚胎，经短暂的离心处理后，在显微操作仪下，用一种显微操作针将1皮升含有500～600拷贝线性化DNA的分子缓冲溶液注入到受精卵的雄原核（malepronuclei）中，然后将此卵移植到假孕的雌性小鼠子宫内，三周后生下幼鼠，剪断幼鼠的尾巴，从尾巴中分离DNA供PCR分析,以确定是否存在转入的DNA序列。46负压正压DNA微注射针DNA显微操作仪卵显微操作仪卵固定管倒置显微镜皮克注射控制器注射器用显微操作仪和DNA微注射针将纯化的外源DNA直接注入到小鼠受精卵的雄原核中。(a)胚胎注射的三种基本的仪器是放大率为400倍的导置显微镜，装有带负压持卵针的显微操作仪（左）和装有DNA微注射针的显微操作仪。47负压极体雌原核细胞膜DNA注入到雄原核中核仁透明带(b)用微注射针将皮克量纯化的DNA(1μg/ml)注入固定在固定管上的受精卵的雄原核中。48

转基因“建立者”小鼠和同窝中的非转基因小鼠回交通过PCR阳性来鉴别出第一代阳性小鼠。

(a)将经注射激素，超数排卵的雌鼠和种雄鼠交配，然后分离受精卵，将DNA显微注射入受精卵细胞中。显微注射20～30个受精卵，然后移植入假孕雌鼠的子宫中，19天后生产5～8个左右的幼鼠。3周后从同窝的转基因小鼠的尾巴中采样，通过PCR分析鉴别阳性小鼠。49转基因DNAPCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR的产物用EB染色凝胶种雄鼠超数排卵雌鼠分离受精卵将转基因DNA显微注射入卵中19天G0幼鼠3周从尾巴中分离DNA供PCR分析用对照组PCR产物将经显微注射的卵植入假孕雌鼠的子宫中50回交M4小鼠的生殖细胞中不含转基因DNAM2小鼠是建立者动物通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR的产物G1幼鼠(b)通过PCR分析鉴别出的阳性小鼠与非转基因鼠回交来鉴别含有生殖系DNA整合建立者动物。

51在转基因小鼠中，细胞特异启动子能在特异类型组织中表达外源基因。图中的实验表示前列腺特异启动子能被用来产生前列腺癌的转基因鼠模型。由于DNA整合到小鼠的基因组中的特定区域，影响转基因启动子特异表达。经RNA印迹分析可鉴别带有预期转基因表达模式(PO2)的“建立者”小鼠。研究了“建立者”子代小鼠的经前列腺组织可以确定那些是人类前列腺癌的转基因模型鼠。

52显微注射受精卵通过回交和PCR分析鉴别建立者小鼠从“建立者”鼠的肝、肾和前列腺中分离RNA,并通过RNA印迹分析PO3PO1PO4PO253癌基因转录本肌动蛋白PO2“建立者”品系具有特异的前列腺癌基因表达PO2雌鼠没有卵巢肿瘤PO2雄鼠在青春期前没有前列腺肿瘤PO2成年雄鼠具有有大的前列腺肿瘤54二、通过干细胞的同源重组进行基因敲除

在“敲除(knockout，KO)”小鼠产生之前有两种方法取得了突破，这两种关键的发明是：（1）培养多潜能性小鼠胚胎干细胞(embryonicstem，ES)

，它能和非转基因鼠的囊胚组合；（2）建立了DNA克隆载体和筛选细胞系的方法，使被转染的细胞和外源DNA经历了同源重组。55细胞被转染新霉素类似物GCV9-鸟嘌呤药物前导物培养基56定向突变(targetedmutation)或敲除。(1)在体外将neor基因插入到克隆基因蛋白质编码区中，使其失去活性，构建成寻靶载体。(2)将带有双标记的载体导入到从小鼠胚分离出的细胞中。(3)结果会发生三种情况:

(a)一是载体上的插入了neor标记的外源基因与细胞内正常的同源基因发生同源重组，使染色体上带有了定向插入基因，同时也插入了neor标记基因，而tk

基因仍然留在载体上，未能插入到染色体上（上）；

(b)整个的载体随机地整合到染色体上，未发生同源重组，但将双标记都带到了染色体上（中）。

57(c)载体未能插入到染色体上，更不会产生同源重组，双标记都留在载体上（下）；（4）筛选分离带有定向突变的细胞

。将各种细胞都铺在含有选择剂新霉素类似物(G418)和GCV(9-[1,3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤)的培养基上。G418可使细胞致死，但含有neor基因的细胞具有抗G418的功能。因此可以排除未被靶基因取代的细胞。而GCV是有毒的物质，当单纯性疱疹病毒的tk

基因存在时，胸苷激酶可催化GCV作为底物参与DNA的合成，使细胞致死。因此用它可以排除随机整合载体的细胞。结果只有定向插入外源DNA的细胞才能在培养基上存活，增殖。

58棕褐色雄性种鼠超数排卵棕褐色雌鼠三天后从子宫里分离囊胚在滋养细胞上培养囊胚滋养细胞层内细胞团(ICM)亚克隆ICM细胞干细胞上皮细胞展平ES细胞用电穿孔对ES细胞进行转化DNA线性化转基因DNA59用G418选择生长的neor细胞系鉴别含有破坏基因的ES细胞用转基因引物进行PCR分析用转基因探针进行DNA印迹60

剔除（knockout）

（1）首先是将想要剔除的小鼠基因插到载体上进行克隆。再将新霉素抗性(neor)标记插入这个基因，使这个基因受到破坏，这段DNA称为定向插入DNA。在此基因外侧再导入一个胸苷激酶（tk）基因，作为选择标记。（2）从棕色小鼠的胚中分离，收集胚胎干细胞（embryonicsterm,ES），将重组载体转染ES；61(3)转染后会产生三种不同的结果：

①载体上定向插入DNA和染色体上的靶基因进行同源重组，使染色体上带有了定向插入DNA(即被破坏了的基因)和neor，但不带有外侧的tk

；②重组载体随机插入到染色体中，未进行同源重组；③重组载体未能插入到染色体中；受体染色体未发生改变。62(4)收集转染细胞，在培养基中加入G418和GCV

(9-1,3-二羟-2-丙氧甲基鸟苷

)，neor可将具有定向插入DNA的细胞选择出来；GCV可杀死所有带有tk的细胞，这样可将随机插入和未重组的细胞都杀死。最后培养基上仅留下带有定向插入的细胞。

(5)将带有定向插入的细胞（A/A；M/m）注入黑色雌鼠(a/a；M/M)的囊胚腔中,使胚胎成为嵌合体。

(6)将嵌合胚植入作为代理母亲的黑色雌鼠子宫里，嵌合体发育成嵌合小鼠（带有黑色斑纹的棕色小鼠）。63

(7)嵌合小鼠发育成熟后，选择雄性小鼠（a/a,M/M;A/A,M/m）和黑色雌鼠(a/a；M/M)杂交，生育的子代中有：①黑色鼠（a/a；M/M

）；②棕色鼠（A/a,M/m

）；③棕色鼠（A/a,M/M）。

(8)再将棕色鼠（A/a,M/m）互交，将产生4种不同基因型的后代：①A/-,M/-

(棕色)；②A/-,m/m

(棕色)，是我们要得到的纯合的剔除基因小鼠。③a/a,M/-（黑色）。

64定点突变棕色鼠正常的染色体a/a：M/M黑色母鼠从棕色鼠分离出胚胎干细胞囊胚阶段的胚代理母亲生育的嵌合雄鼠(带有两种小鼠的细胞系)胚胎A/A：M/Ma/a：M/M+A/A：M/m嵌合的的胚

6566

寻靶载体

(targetingvectors)

有两种基本的基因寻靶方法。

(1)最简单的方法是依赖一个基因插入的过程，此需要寻靶载体的末端和基因组之间的交换。通过插入产生的结果是靶序列和具有选择标记（如neor）的插入序列重复。

(2)第二种是用基因置换的方法。基因置换载体含有两个选择标记，提供了一个鉴别ES细胞是否在靶基因发生了双交换的方便方法。

67通过插入来敲除基因基因组用G418来选择neor基因neorampr68通过置换来敲除基因用G418来选择neor基因用9-鸟嘌呤选择HSVtk缺失69

三、人类疾病的转基因小鼠模型

小鼠转基因的一个目的是用分子遗传学的方法产生人类疾病的模型，来了解遗传缺陷。

1996年哈佛医学院C.Tabin实验室提出发现IHh控制骨头的发育；

1999年哈佛的A.McMahan发现剔除小鼠IHh基因后有许多异常，包括骨头缩短。

2001贺林等将A-1型短指（趾）症的致病基因定位于2号染色体长臂的35－36区，并发现IHH（Indiahedgehog）基因的3个不同突变位点均能导致短指（趾）症的发生。70用培养的胚胎干细胞敲除Hoxc-8基因。(a)Hoxc-8突变小鼠的胸椎和腰椎。野生型小鼠的第一腰椎是没有肋骨的。(b)纯合的敲除Hoxc-8基因小鼠（右）的趾紧握。野生型（左）小鼠的趾正常71第四节转基因家畜基因动物用于生产具有药用价值的重组蛋白的生物反应器（bioreactors）。用转基因制备药物的这项工作发展缓慢，其原因是：（1）大型家畜的转基因传代时间长，后代少。另外由于卵细胞的显微注射导致DNA的随机整合，结果使基因表达出现遗传变异，产生不可预知的后果。（2）公众关心来自转基因动物的食品，如人源化的牛奶可能不被消费者广泛接受。（3）动物保护主义者质疑转基因是否会减少生物的多样性，大规模生产的程序是否影响到动物的安全。72一．用转基因动物制备药物1992年，英国爱丁堡大学的研究人员生产出6头转基因绵羊。这些绵羊可以在奶中生产抗胰蛋白酶（一种治疗肺胞纤维化病变的多肽药物），产量最低的是1g/L，产量高的可达35g/L。这篇研究报告立即在科学界和企业界引起轰动，许多正在进行相关领域研究的科学家纷纷将目标移向建立乳房反应器系统来合成作为药物的重要蛋白。737475用DNA共转染的分子遗传学和核移植技术是能产生产药动物。此图表示罗斯林研究所的科学家们用脂质体介导基因转移到从无角多塞特白面母绵羊分离出的二倍体胚细胞中，

所用的载体是带含有人类IX因子cDNA的乳腺特异表达载体(pMIX1)。在IX因子编码序列的上游是绵羊的β-乳球蛋白(BLG)

启动子。使异源基因在绵羊的乳腺中能高水平的表达。以这种共转染的方法，另一个质粒含有来自磷酸甘油酸激酶启动子(pPGKneo)的neor

基因，提供了一个用G418

来选择的稳定转染的选择标记莫莉和波莉是首批两只转基因产药动物。这两只羊含有有产药价值的人类基因。

76

二、动物的体细胞克隆英国爱丁堡苏格兰罗斯林研究所和英国PPL医疗公司的IanWilmut

和

KeithCampbell等从一头６岁芬兰多塞特白面母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低血清的培养液中，细胞逐渐停止分裂，进入G0期，以便和受体的细胞周期同步。77

此细胞作为“供体细胞”。再从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并通过显微操作仪将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，作为“受体细胞”。用电穿孔使供体细胞和受体细胞融合。融合细胞经6天的培养，细胞分裂、分化，一共产生29个多细胞的“胚胎”；最后将这些“胚胎”转移到13头苏格兰黑面母绵羊的子宫内，经过148天的发育分化，最后产下了一头成活的小绵羊，罗斯林研究所的科学家们以他们最喜欢的乡村歌手DollyParton

的名字来命名这头小羊。

78苏格兰黑面母绵羊芬兰多塞特白面母绵羊从乳腺中分离二倍体体细胞从卵巢中分离卵细胞用显微操作除去单倍体核用低血清培养使细胞处于G0期79通过电穿孔使细胞融合培养6天将囊胚移植到作为代理母亲的黑面羊子宫里150天后生下小羊多莉80歌手DollyPartonNature,385(1997),封面81

动物体细胞克隆中存在的问题。①体细胞克隆时，如何恢复雌性供体中失活的X染色体的活性？例如2001年美国得克萨斯农业和机械大学

M.Westhusin等成功地克隆出了小猫“科比”。科比的供体是三色猫，其遗传结构应和供体相同，但毛色和供体却有一定差异。如果克隆动物的X染色体上带有突变基因，那么，也可能因缺乏相应的野生型等位基因而致病。82(a)克隆猫“科比”的供体(b)克隆猫“科比”和其代理母亲(c)克隆猫“科比”2001年第一只克隆猫“科比”诞生。其供体是一只三色猫（a）其代理母亲是一只灰色带黑色条纹的猫（b）而“科比”的花色模式和其供体相同，但仅有黑和白两种毛色。表明其来自单克隆细胞。83②如何恢复端粒的长度？当多莉两岁半时，人们测定其端粒的长度与核供体的年龄一致，而不与其本身实际年龄不一致。因近年来研究表明，端粒长度的缩短与哺乳动物的疾病和衰老密切相关。核移植后，端粒长度变化的机理如何？对动物寿命的影响如何都需要进一步研究。84③如何实现正常的亲本印记（parentalimprinting）？

这些表观遗传标记建立于生殖细胞，而在所有体

细胞中得到维持。实验表明仅含有母源基因组

(孤雌生殖)或者仅包含父源基因组(雄核发育)的胚胎都在发育过程中常常表现异常。体细胞克隆动物未经过受精，也是来源单个亲本，只能维持亲本的遗传印记，如有遗传缺陷后代就难以避免。所以就有必要利用靶向修饰（甲基化或去甲基化）改变这种情况。85

转基因产药动物1997年12月罗斯林研究所又诞生了两只转基因羊羔，叫“莫莉（Molly）”和“波莉（Polly）”是首批两只转基因产药动物。这些转基因产药动物是用哺乳动物含有人类凝血因子IXcDNA的乳腺特异表达载体(pMIX1)稳定转染供体细胞而产生的，而供体细胞是来自动物胚胎细胞。

莫莉和波莉不仅彼此遗传性相同，带有相同的绵羊基因，而且将来在每一个羊羔的乳汁中又可产生大量的人类血凝因子IX。86pMIX1pPGKneo脂质体介导共转染苏格兰黑面母绵羊无角多塞特白面母绵羊用显微操作除去单倍体核分离二倍体胚胎细胞用G418-选择并分离克隆鉴定的DNApPGKneo

＋pMIX1只有pPGKneoβ-乳球蛋白启动子87通过电穿孔使细胞融合培养6天将囊胚移植到作为代理母亲的黑面羊子宫里150天后生下小羊波莉莫莉产药动物88

乳房反应器系统的优点是：（1）利用高等哺乳动物乳腺的特异基因启动子可直接表达人类可溶性转基因蛋白。（2）动物乳腺细胞可以使任何基因正确表达和加工。生产出来的蛋白质与天然产品在结构和功能相同；（3）由于乳汁蛋白不会输送到转基因动物的血流和淋巴流中，因此不会对转基因动物产生对有害的副作用。（4）乳中的蛋白质种类较少，转基因在奶中表达的外源蛋白产量高，易于提纯。89

檀香山技术(Honolulutechnique)

夏威夷大学的Wakayama等报导了另一项突破。表示他们建立的称为“檀香山技术”产生了一只名叫“卡姆莉(Cumulina)”。檀香山技术和罗斯林研究所的方法之间的差别是：（1）使用卵丘细胞，处于自然休眠期(Go)，不需“饥饿培养”；（2）将核直接注入去核的卵中，方法简便。（3）重构的卵母细胞的激活采用化学法-锶离子（电脉冲）；（4）提高了成活率至2.35%，比多莉羊高5-6倍(Dolly1/277)。90

檀香山核转移技术利用微注射产生二倍体卵细胞来克隆动物。通过将经微注射的卵放在含有锶的无血清培养基中在体外激活卵母细胞，

在激活卵母细胞中含有的细胞松弛素B能阻止极体形成，这是由于使其丢失了染色体。

91除去原核的单倍体卵细胞从二倍体体细胞中取出核将二倍体核注入卵细胞中92在体外激活卵母细胞并进行胚胎培养将胚植入假孕母鼠的子宫里93在1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹们。

94第五节实践7：敲除转基因鼠产生特异基因

一、研究目的一个研究生设计了一项实验来验证在脑中豆极基因(bean

pole，b