抗生素质量控制

第三章

抗生素第五节抗生素质量控制

一

性状头孢哌酮钠：白色或类白色的结晶或粉末；二鉴别试验呈色反响：与羟胺作用生成羟肟酸，与铁离子呈色。类似于肽键反响，双缩脲反响和茚三酮反响钾钠离子的焰色反响普鲁卡因青霉素有芳伯氨基，可以发生重氮化-偶合反响，生成红色染料沉淀。光谱法：包括红外吸收光谱〔IR)和紫外吸收光谱(UV)色谱法:与对照品的高效液相色谱〔HPLC)和薄层色谱(TLC)的保存时间和比移值一致【鉴定】沉淀反响取本品10mg，加硝酸0.5ml使溶解，加水0.5ml，火焰加热〔灼烧〕2分钟，放冷，滴加硝酸银试液，即生成白色凝乳状沉淀三一般工程检查抗生素药物的检查工程包括：①鉴别试验②异常毒性试验③无菌试验④热原试验⑤降压试验⑥酸碱度试验⑦水分测定⑧溶液澄清度检查⑨效价测定⑩其他检测〔抗生素组分、有关物质、比重度、熔点、晶型、溶媒残留量、重金属、溶出度等〕。异常毒性系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药，在规定时间内观察小鼠死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。热原将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。采用“鲎(hou)试剂〔内毒素检测试剂〕〞法检查。降压物质、升压物质无菌试验：指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法。微生物限度检查：检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法。检查工程包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。杂质毒性杂质非毒性杂质溶出度不溶性颗粒【杂质检查】--液相色谱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐溶液-乙腈〔40：60〕为流动相；波长为215nm。按红霉素C、红霉素A、红霉素B的顺序出峰。另取红霉素标准品适量，130℃加热破坏4小时，液相色谱分析。记录色谱图至红霉素A保存时间的5倍。按红霉素C、红霉素A、杂质1、红霉素B、红霉素烯醇醚峰的顺序出峰。杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积〔5.0%〕。四、含量测定碘量法：采用剩余碘量法测定，以标准对照法计算含量。电位配位滴定法：青霉素碱水解产物可以与二价金属离子形成配合物，故采用碱水解后用硝酸汞进行滴定。紫外可见分光光度法：青霉烯酸在320nm~360nm有强吸收，外标法测吸光度。高效液相色谱法：开展最快的分析方法，使用反相的HPLC法，以外标法作标准曲线计算含量。〔1〕含量测定—液相色谱分别加甲醇溶解，用磷酸盐缓冲盐〔pH7.0〕-甲醇〔15︰1〕定量稀释制成溶液，分别作为供试品溶液和标准品溶液；精密量取供试品溶液与标准品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中红霉素A的含量。药典规定：按无水物计算，不得少于88.0%。〔2〕、抗生素类药物含量的理化测定法抗生素类药物含量分析测定方法分为理化方法和生物学方法.理化方法以化学、物理化学方法测定主药含量，准确度高、简单、快速，但不一定代表生物效价，且易受杂质干扰。生物学方法主要是通过测定抗生素抑菌或杀菌的能力来表达其效价，与临床效果一致，灵敏度高，干扰物质少，但操作繁琐、培养时间长、测定误差大。例青霉素钠Ch.P〔2000〕【鉴别】〔1〕取本品与含量的青霉素适量，分别加水制成每1ml中约含50mg的溶液，各取1ml，参加不少于200单位的青霉素酶溶液1ml,在37℃灭活1小时后，取灭菌滤纸片，分别用上述溶液浸湿后，用滤纸吸去多余的液体，置摊布金黄色葡萄球菌[CMCC〔B〕26003]的培养基上。在37℃培养约16小时后均无抑菌作用，而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用.例1青霉素含量的测定青霉素在水溶液中经水解后，产生青霉噻唑酸，可用酸碱滴定法测定。或用直接滴定法，或用逆滴法进行测定，最后均以碱标准溶液的消耗量来计算青霉素的含量。终点观察：用目视指示剂或电位滴定均可。温度对指示剂的变色范围有影响。碱性指示剂，温度升高时，对氢离子的灵敏度降低，变色范围偏向较低的pH值，如甲基橙在室温时为pH3.1～4.4，在100℃时，移到2.5～3.7。酸性指示剂对温度的影响不太敏感。指示剂的用量不宜多，过多时，因指示剂本身也消耗酸或碱，变色较慢。在水溶液中，大局部羧酸在pH约8.4时中和，一般可用酚酞指示剂〔无色到红色〕，也可采用百里酚酞〔无色到蓝色〕或百里酚蓝〔黄色到蓝色〕等。滴定剂的选择，一般选用氢氧化钠或氢氧化钾标准溶液作滴定剂。标准碱液一般采用新沸冷却蒸馏水进行稀释制备。贮存标准碱液的容器要密封，以免吸收二氧化碳而影响碱液质量。例2青霉素钠的含量测定精密称取本品约0.3～0.4g，加新沸过的蒸馏水20mL使其溶解，加0.01mol/L氢氧化钠液中和后，精密加0.1mol/L氢氧化钠液25mL，95℃左右水浴20min。冷却后，加酚酞指示剂2滴，用0.1mol/L盐酸滴定，从粉红色至无色。不加供试样品作为空白，重复以上操作。两者滴定数的差即为所消耗氢氧化钠的量。计算：式中，MHCl表示0.1mol/L盐酸液的准确摩尔数；A表示供试品滴定所需0.1mol/L盐酸液体积〔mL〕，B表示空白滴定所需0.1mol/L盐酸液体积〔mL〕。讨论：水解前先中和溶剂和样品；空白试验校正〔消除CO2干扰〕；加热时防止吸收CO2。用于含量测定的方法有下述几种：A、对照品比较法按药典规定的方法，分别配制供试品和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100％+10％。所用溶剂完全一样，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度。Cs表示供试品溶液浓度；As表示供试品溶液吸收度；Cr表示对照品溶液浓度；Ar表示对照品溶液吸收度。B、标准曲线法取数份梯度量的对照品〔标准品〕溶液，用溶剂补充至同一体积，测定每份的吸收度。以吸收度与浓度关系绘制标准曲线。将供试品配制成标准曲线范围内的浓度，在同样条件下处理和测量其吸收度，再在标准曲线上求出含量。C、吸收系数法假设供试品与百分吸光系数的纯品为同样物质时，可按药典规定方法配制供试品溶液，测定供试品的吸收度A，求出供试品的百分吸光系数，再求得供试品中该物质的含量。供试品含量〔％〕=Et/Es×100%其中，Es表示纯品的百分吸光系数；Et表示测得的供试品的百分吸光系数。紫外分光光度法多用于抗生素制剂中抗生素含量测定。如测定奥格门汀〔复合制剂〕中羟氨苄青霉素和克拉维酸的含量；测定麦迪霉素胶囊中麦迪霉素的含量；用金属离子络合物测定土霉素制剂中的土霉素含量等等。比色法用于多种抗生素的效价测定。如青霉素和头孢菌素的羟胺比色法测定抗生素效价；链霉素的麦芽酚法测定链霉素效价；三氯化铁比色法测定土霉素效价等。〔3〕色谱法测定法色谱法在抗生素药物分析中，主要用于鉴别定性及定量〔如杂质、异构体的限度试验和组分分析〕。〔4〕高效液相测定法在每种抗生素进行检测前要求对仪器进行系统适应性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应到达规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、别离度和拖尾因子。高效液相色谱在抗生素类药物的定性、定量分析中应用的愈来愈多，如半合成青霉素、头孢菌素的衍生物的含量测定；丝裂霉素、灰黄霉素的效价测定；一些抗生素制剂中抗生素含量的测定等。抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素的医疗价值。利用抗生素对细菌〔或霉菌〕的杀死或抑制的程度，设计了抗生素效价的生物检定法。几十年来微生物检定法仍为各国药典所采用。测定抗生素效价的微生物法，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法等方法。设C=40U/mL，那么本法测定误差较大，各国药典均未收载，一般用于测定抗生素对试验菌的最低抑菌浓度或最低杀菌浓度。2、比浊法细菌生长产生的浊度与细菌数的增加、细菌群体质量的增加和细菌细胞容积的增加之间，存在着相关性，在一定的范围内符合比耳定律。将抗生素标准品的稀释液与供试品的稀释液分别参加试管中，再参加已接种试验菌的液体培养基，摇匀，置37℃的培养箱中培养24h后，观察试验菌生长情况。由于抗生素浓度不同，试验菌受抑制的程度也不同，因而产生不同程度的混浊。用分光光度计测定其透光率或吸收度，用标准曲线法可测定出供试品的效价。取每mL含24.0、26.8、29.9、33.5和37.5U的链霉素标准品溶液各1mL，分别参加15支试管中(3个平行)。另取试管3支，每管中各参加供试品溶液1mL。18支试管中各参加已接种试验菌的液体培养基9mL，摇匀。将标准品管和供试品管置37℃培养箱中培养2～4h后，取出，分别于每管中各参加12％甲醛溶液0.5mL，摇匀，即可于分光光度计上530nm处以未接种试验菌的液体培养基9mL，加蒸馏水1mL，12％甲醛溶液0.5mL，摇匀作为空白，测定各管内培养物的透光率。以透光度为纵坐标，链霉素浓度为横坐标绘制标准曲线，那么可在标准曲线上查出供试品的效价。3、琼脂扩散法(diffusemethod即管碟法)管碟法是目前国际上测定抗生素效价的通用方法。我国药典收载的微生物检定法也是管碟法。此法灵敏度高，但操作较麻烦，影响试验结果的因素较多，需要从各个操作步骤严格控制试验条件，尽可能减小试验误差，才能使试验结果到达精密、准确。一原理在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑菌圈的外表积或直径成正比，可以得出一条曲线。抗生素浓度换算成对数，那么抑菌圈直径与抗生素对数成直线关系第二节管碟法测定抗生素效价原理和方法管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度〔剂量〕与抑菌圈面积或直径成正比。〔一〕管碟法测定原理〔二〕管碟法的材料类别实验菌培养基PH链、卡庆、红枯草芽胞杆菌Ⅰ7.8-8.0四、土氯、林滕黄八叠球菌Ⅱ6.5-6.6

管碟法测定操作

1.

试验用菌液、缓冲液、培养基的制备

按规定进行制备。2.标准品与供试品溶液的制备按药典规定制备标准品与供试品上下不同浓度溶液。3.双碟的制备制备底层及含一定量试验菌的菌层，并安置小钢管。4.滴加药液到小钢管内将标准品、供试品溶液滴入相应的小钢管中。5.培养在恒温培养箱中培养至规定时间。6.测量抑菌圈可用手工测量或仪器测量。7.计算结果先进行可靠性测验,符合规定,再进行效价计算①培养基及其制备方法②灭菌缓冲溶液③菌悬液的制备④标准品溶液的制备⑤供试品溶液的制备⑥双碟的制备⑦检定法管碟法测定操作抗生素效价检定管碟法操作流程标准品的称量

→标准品的稀释→标准品溶液

缓冲液的制备

供试品的称量

→供试品的稀释→供试品溶液

--─┐┌───平板的制备────┐

底层20ml─→菌层5ml─→培养基的制备→

菌液的制备

加菌液

可靠性测验，计算结果

←──测量抑菌圈←─培

养

加小钢管加陶瓦园盖1.

试验用菌液金黄色葡萄球菌悬液：取金黄色葡萄球菌的营养斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35~37℃培养20h到22h:临用前用水或者灭菌生理盐水溶液将菌苔洗下，备用。大肠杆菌悬液：取大肠杆菌的营养斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35~37℃培养20h到22h:临用前用水或者灭菌生理盐水溶液将菌苔洗下，备用。细菌浓度：在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度〔菌液浓度约为10个/mL〕。标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。供试品应放于枯燥器内至少30min方可称取。称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的枯燥参加剂应保持经常注意更换。称量结束后，超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。2供试品及标准品的配制在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。

双碟的制备：取内径90mm、高16—17mm的平底双碟；注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48－50℃〔芽孢可至60℃〕，参加规定的试验菌悬液适量〔能得清晰的抑菌圈为度。〕二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18－24mm。放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否那么会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记。滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内双碟在37℃下培养约16~18h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长那么会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。〔二〕抑菌圈的形成在平板底部四边，分别对角注明“SH〞、“SL〞和“TH〞、“TL〞标记将不锈钢小管(俗称为牛津杯)放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上。THSLSHTL以无菌滴管分别在每个牛津杯内参加相应的抗生素溶液至满但不溢出管外且四杯内液面高度相同，盖上平皿盖，静置30分钟。〔二〕抑菌圈的形成将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培养基中的试验菌开始生长。〔二〕抑菌圈的形成抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。

抗生素分子在琼脂培养基中的浓度，随离开小钢管的距离增大而降低。离小钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分子愈少，相应的抗生素浓度愈低。

当抗生素分子扩散到一定时间，在小钢管周围形成一个能有效的抑制试验菌生长的范围，也就是通常所说的抑菌圈。抗生素溶液的浓度不同，抑菌圈的大小亦不同(图)〔二〕抑菌圈的形成用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中剩余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关；比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。按设计原理不同分管碟法一剂量法〔标准曲线法〕：常用于原料生产的过程监控、中间体或半成品检验二剂量法：抗生素质量检验的常规方法三剂量法：主要用于标准品的标定〔2005年版〕收载了二剂量法和三剂量法。多采用二剂量法，对于有争议结果，必须使用三剂量法测定的结果仲裁。二剂量法将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例〔2:1或4:1〕的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性。取含菌层的双层平板培养基，每个平板外表放置4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按公式计算出检品的效价。求出W和VW=〔SH+TH〕-〔SL+TL〕V=〔TH+TL〕-〔SH+SL〕TH供试品高剂量的抑菌圈TL供试品低剂量的抑菌圈SH标准品高剂量的抑菌圈SL标准品低剂量的抑菌圈计算检品的效价⑧统计计算与结果判定供试品效价相当于标示量或估计效价的百分数θ=D㏒-1[(TH＋TL－SH－SL)×I)×100TH＋SH－TL－SL计算出检品的效价求出θ=D·lo