单四极杆型LCMS简介课件

单四极杆型LCMS简介潘翔博士江苏天瑞仪器股份有限公司天津市理化分析中心2012.12.01.内容目录MS历史LCMS结构质量分析器、离子源、真空系统、真空接口、离子传输、检测器仪器指标软件调谐校准、数据采集、数据分析、数据库检索应用实例.什么是质谱？物质的基本信息：分子量（分子的重量）而现有的有机物的分子量从16Dalton（CH4）到几千万Dalton（蛋白质）都有身高多少？分子量多少？.质谱早期历史（1）J.JThomson在20世纪初对阳极射线的研究直接导致质谱的发明。J.JThomson,RaysofPositiveelectricity,1911.质谱早期历史（2）最早的质谱图AstonF.W.IsotopesandAtomicWeights,Nature,1920未找到原文章,转自.质谱历史－磁质谱DempsterA.J.

Anewmethodofpositiverayanalysis

Phys.Rev.,1917,XI(4),p.316J.Mattauch,R.HerzogÜbereinenneuenMassenspektrographenZeitschriftfurPhysik,1934,89,p.786.质谱历史－飞行时间质谱1946年TOF（飞行时间质谱）概念出现.质谱历史－最早的飞行时间质谱CameronA.E.,EggersD.F.Jr.AnIon"Velocitron"TheRev.ofSci.Instrum.,1948,19(9),p.605.质谱历史－四极杆质谱的出现PaulW.,SteinwedelH.EinneuesMassenspektrometerohneMagnetfeldZ.Naturforschg.,1953,8a(),p.448.质谱历史－最早的ESI（电喷雾离子源）DoleM.,MackL.L.,HinesR.L.,MobleyR.C.,FergusonL.D.,AliceM.B.MolecularbeamsofmacroionsJournalofChemicalPhysics,1968,49(5),p.2240.质谱历史－ESI离子源YamashitaM.,Fenn,J.B.ElectrosprayIonSource.AnotherVariationonthefree-jetthemeJournalofPhysicalChemistry,1984,88(20),p.4451.质谱历史－最早的APCI（大气压化学电离）CarrollD.I.,DzidicI.,StillwellR.N.,HaegeleK.D.,HorningE.C.AtmosphericPressureIonizationMassSpectrometry:CoronaDischargeIonSourceforUseinLiquidChromatograph-MassSpectrometer-ComputerAnalyticalSystemAnalyticalChemistry,1975,47(14),p.2369.质谱历史－诺贝尔奖JosephJohnThomson

1906NobelPrizeforPhysics

"inrecognitionofthegreatmeritsofhistheoreticalandexperimentalinvestigationsontheconductionofelectricitybygases"FrancisWilliamAston

1922NobelPrizeforChemistry

"forhisdiscovery,bymeansofhismassspectrograph,ofisotopes,inalargenumberofnon-radioactiveelements,andforhisenunciationofthewhole-numberrule"WolfgangPaul

1989NobelPrizeforPhysics

"forthedevelopmentoftheiontraptechnique"JohnBennetFenn

2002NobelPrizeforChemistry

"forthedevelopmentofsoftdesorptionionisationmethods(ESI)formassspectrometricanalysesofbiologicalmacromolecules"KoichiTanaka

2002NobelPrizeforChemistry

"forthedevelopmentofsoftdesorptionionisationmethods(MALDI)formassspectrometricanalysesofbiologicalmacromolecules"18December1856–30August1940(1September1877–20November1945)(August10,1913–December7,1993)(June15,1917–December10,2010).质谱应用的发展FromR.GrahamCooks课程内容.历史角度看LCMS新型的分析器原理在过去的100年中只出现了少数几种－磁，飞行时间，四极杆，离子阱。新的原理往往伴随着质谱的革命。所有这些技术都已用在了LCMS上。离子源是另一个容易产生技术革新的领域，在过去的20年出现的最重要的几种离子化技术，大部分都用于LCMS，例如ESI，APCI，Maldi，DESI，DART。未来LCMS技术革新的方向预计将是向生物方向倾斜.质谱现状更高，更快，更强更高：分辨率，质量数范围更快：扫描速度，快速检测离子源更强：应用范围更加的广泛，生物，医药等.四极杆质谱-结构简介回到我们将要专注的四极杆LCMS离子源真空接口离子传输器质量分析器检测器信号采集数据分析真空系统分子离子离子被筛选离子被检测信号采集转为电脑数据.单四极杆LCMS举例(天瑞LCMS-1000).真空系统为什么要真空？1.保护作用四极杆加载着2000－4000V的高压，在非真空环境下，放电导致损坏仪器电路和四极杆最常用的几类检测器都需要工作在真空环境下，不恰当的真空会直接击穿检测器2.降低碰撞概率在非真空环境下，离子，分子之间的碰撞非常频繁，无法利用电场，磁场规范离子运动，导致离子的运动行为不可测.真空系统－平均自由程平均自由程：分子两次碰撞之间自由运动的平均距离.真空系统－真空腔离子＋气体分子离子离子透镜气体分子1000mbar10－5—10－6mbar分析器早期质谱，从大气压直接通过小孔至10－5mbar,如果通过一个100um的孔，后一级真空的分子泵抽速要达到100，000L/s！（对比现在常用的70－500L/s分子泵抽速）成本高昂，容易堵塞.真空系统－真空腔目前主流LCMS都采用了多级真空系统离子＋气体分子离子离子透镜气体分子10－5—10－6mbar分析器10－3mbar1mbar1000mbar多级真空系统，有效的降低了成本，提高离子的通过率从而提高了信号。.如何获得真空－机械泵机械泵结构原理一般在不进气的情况下，能够抽到10-2mbar在选择替换旧泵，坏泵时，主要的参数是抽速，一般用在LCMS上的机械泵抽速多在10－30m3/hr泵油建议半年换一次，排气管道务必通至室外/microanalysis/microprobe-sem/instrumentation.html.真空系统－分子泵某品牌的分子泵http://www.osakavacuum.co.jp/en/products/pump_turbo/genri.html结构示意图.真空系统－分子泵原理http://www.osakavacuum.co.jp/en/products/pump_turbo/genri.html结构比较精密的泵，一旦出现问题，务必不要自己拆开！虽然现在的分子泵都有快速停止功能，为了泵的安全和寿命，建议留够30－60分钟等待分子泵完全停止部分分子泵每隔一段时间需要添加少量油润滑轴承，购买质谱时，最好知道自己的质谱所使用的分子泵是否需要维护启动分子泵之前务必先启动机械泵；分子泵完全停止后再停止机械泵！尽量避免液态水，气态水进入真空维护的好，分子泵的寿命很长，从而延长质谱的时候年限，维持质谱的仪器测试水准.真空系统－流量离子透镜5×10－5mbar分析器3×10－3mbar0.5mbar1000mbar3.753.00.750.7150.035单位为mLatm/s简单模型下，假设使用常用泵抽速，多级真空系统的进气量最终到分析器的气体量只有1%.真空系统－真空规真空规有很多种，在LCMS中常用的是pirani和冷阴极组成的复合规(在10－4mbar左右切换)Pirani计（1000mbar-10-4mbar）/newweb/Gauges/gauges_technicalnotes_1.cfm/literature/transactions/volume3/high3.html冷阴极（10-3mbar-10-9mbar）如果您的质谱，气压反馈始终都在10-4mbar左右，有理由怀疑真空规有问题热阴极（10-3mbar-10-9mbar）.真空系统－需要注意的其他事项Hagen-Poiseuille推导公式。用于计算圆管的气导。为了提高抽真空的效率，尽量使用短而粗的气管连接机械泵，分子泵和真空腔；例如对于25m3/hr（7L/s）的机械泵，如果使用两根60cm长，1.6cm的气管连接到分子泵和真空腔，那么在真空腔这端的抽速会降低到5L/s！尽量减少接头的时候，需要用接头时，尽可能的使用U型，避免使用V或Γ型真空规定期应该清洗一次，以保证真空反馈数值的准确性，保证质谱的安全 1/S=1/Cpump+1/Cpipe1＋1/Cpipe2＋1/Cpipe3…..+1/Cconnector1+1/Cconnector2+…..总的气导类似于并联电阻的总电阻.休息一下…..质谱的结构可以变得非常非常的复杂…….质量分析器FromSummercoursebyProfessorZhengOuyang.四极杆优缺点LCMS的质量分析器可以是飞行时间，离子阱，四极杆等类型目前的主流还是四极杆，虽然四极杆质谱的分辨率（单位质量分辨率）差强人意，但是其价格和对大部分应用需求的满足，还是使得四极杆依然是目前的主流LCMS分析器四极杆的用途不止限于作为质量分析器，也可以作为离子传输器和碰撞反应池理解四极杆的初步理论，对理解谱图和查找问题有着巨大的帮助.四极杆结构四根平行的金属杆，分为两组加载完全相反的电压。电压由交流电和直流电两部分组成xy.四极杆原理简介.四极杆原理那么离子在x，y方向上的运动方程为假定：得到：著名的马休斯方程（MathieuEquation）.马休斯方程马休斯方程是四极杆理论和原理的基础马休斯方程是西尔方程（HillEquation）的一个特别形式马休斯方程的通解形式为.稳定条件.稳定区域.扫描线.四极杆理论的一些推论对于四极杆型的LCMS，分辨率和信号强度不可兼得，分辨率高的时候，离子通过率必然下降，反之亦然。鱼和熊掌的选择….在一般的质谱中，扫描线为直线或分段直线，但是很显然，不同质量数的分辨率不一样，存在微小差别。所以在四极杆LCMS中，存在质量歧视（不同质量数的离子通过率不一样，换而言之，不同离子的仪器响应不一样）离子通过率同样还与离子进入到四极杆的初始状态有关，当离子是聚焦在四极杆中轴线附近入射四极杆时，离子通过率最高。.四极杆的维护不建议大家自己清洗四极杆，尽可能的不要打入过高浓度，黏性大的物质进入质谱，可以减少四极杆表面的污染，延长四极杆的工作年限。有经验的客户，可以小心取出四极杆，用气体吹去表面浮尘。由于四极杆的工作面是靠近中轴线的杆子内表面，清洗外表面作用不大不要使用超声波清洗，四极杆的平行度是依靠陶瓷件和螺钉维持，精密度极高，略有松动，四极杆的性能就会直线下降，以至于完全报废.六级杆及其他多极杆四极杆可以做的事，六级杆或其他多极杆能做吗？答案：不能具体求解过程略去，多极杆（四，六，八等）的离子运动轨迹方程为：.运动轨迹方程对比四极杆：六极杆：八极杆：.为什么只有四极杆可以进行离子筛选？答案：在四极杆内，离子受力，x，y方向是非耦合的。这样离子在x，y方向的运动方式是完全独立的。两个方向上的稳定区域都是固定的.多极杆中离子运动的稳定区间多极杆的运动方程，x，y方向是耦合的，这样离子的稳定运动区域是和离子的初始入射位置，动量有关.四极杆质量分析器总结四极杆内离子运动方程决定了离子运动的稳定区间与离子的初始状态无关，从而成为质量分析器。四极杆属于精密器件，不易自我保养。.休息一下…..离子源离子源是LCMS上技术最多，创新最频繁，推动LCMS发展的一个核心部分。1970年代，科学上普遍都认为LC和MS是没有办法实现联用的（EncyclopediaofMassspectrometry,volume8）为了实现LC和MS（四极杆型）的联用，尝试过的离子化方法：.LC/MS实现联用的尝试Moving-Beltinterface1977Direct-liquid-introductioninterface1980Thermosprayinterface1983FritFAB/continuous-flowFABinterface1985/196Atmospheric-pressurechemicalionizationinterface(大气压化学电离)1986Particle-beaminterface1988Electrosprayinterface1988等等.现在涌现出来的LCMS离子化方法DartDESIPaperSprayInducedSprayAPPIMaldi等等目前主流的LCMS离子化方法都是大气压下的电离,特别是ESI，以及APCI，APPI和Maldi最近5年，Dart，DESI以及各种spray方法逐渐流行起来，可以做快速鉴定，提高效率.FromR.GrahamCooks课程内容.ElectrosprayIoniziton1980年代，ESI（电喷雾）离子化方法发明出来后，LCMS得到了一个飞跃。JohnFenn教授因此获得2002年诺贝尔奖.ESI原理3000－6000V0.5-2cm.泰勒锥的形成说明：可以生成负离子，当电压设为负值.ESI泰勒锥需查找来源.ESI雾状颗粒内部正电荷之间的排斥力随着颗粒体积的变小而增大当颗粒内部电场强度达到Raleigh极限（108V/cm）时，发生coulombexplosions.颗粒分为几个更小的。初始颗粒大小几个微米分为单个离子之前10-25nm.EIS离子源举例（天瑞LCMS－1000）抗污染设计.影响ESI离子化效率的因素

FactorsAffectingIonization针尖的设置（Needlesetup）InnerneedlepositionConditionofneedleNebulizerpressure高电压电极（HighVoltageElectrodes）–CapillaryandChambervoltagesettings–ConditionofCapillaryandChamberhighvoltageelements–Conditionofinsulators溶液的化学性（SolutionChemistry）–Flowrate–SamplepKa–SolutionpH–Solutionconductivity.关于ESI的深入思考形成泰勒锥的电压阈值：ϒ是表面张力，r1为针尖离0电势的距离提示1：产生离子的电压与表面张力相关20°C下，水的表面张力为7.280×10-2N/m乙腈的表面张力为1.910×10-2N/m丙酮的表面张力为2.260×10-2N/m当溶剂为水时，加载在离子源毛细管上的电压要高MatthiasS.Wilm,MatthiasMann,ElectrosprayandTaylor-ConeTherory,Dole’sbeamofmacromoleculesatlast.关于ESI的深入思考喷出的离子流强度与溶液的导电性关系为Ispray~(conductivity)n,n<1部分资料显示，n≅0.22结论：溶液需要有一定的导电性，常用甲酸来增加导电性，但是不是越高越好。另一个关系：Ispray~(流速)m,m≅0.5结论：流速的提高可以增强总离子流，但是考虑到去溶化效果，流速提高并不一定能够提高信号强度。.存在多种物质时的离子强度分配未通过LC的样品直接进入MS时，混合物样品的信号强度并不是只和浓度相关。kA和kB为灵敏度系数，取决于离子的结构，离子迁移和溶剂的黏度.关于ESI的深入思考另一个重要关系10－510－610－310－4110100信号强度浓度（mol/L）EncyclopediaofMassSpectrometry,Vol.6对于单四极杆LCMS来说，在低浓度一端，存在线性关系但是线性范围并不大，对于定量分析要注意这一点。浓度的提高并不一定意味着信号强度的提高.ESI谱图特点简单，往往是AH＋离子.ESI谱图特点ESI的一个巨大的优势就是大分子往往会带多个电荷.ESI总结优点1.大分子往往带多电荷，可以分析大分子2.样品准备简单3.可以分析不稳定物质缺点信号强度对盐和杂质非常敏感多物质多电荷谱图峰多，无法分析结构信息缺乏（单四极杆LCMS的缺点）.APCI（大气压化学电离）原理/details/education/sepspec14874education/Atmospheric-Pressure-Ionisation-of-Small-Molecules.html.典型的APCIFromThermoManual.APCI发生了什么？从原理上说，最后一步的反应取决于A的质子亲和力（ProtonAffinity）如果同时存在A，B两种物质，A与B之间也会存在一个平衡,信号的强度与物质的浓度以及质子亲和力有关。.影响APCI的因素温度温度会极大的影响质子亲和力，同时温度会影响气化效果，从而影响信号。流速流速最大的影响在于流速过大会影响气化效果.水的谱图.APPI.三种离子化方法的（FromAgilentmanual）.其他的LCMS离子化方法都是软电离，敞开式的大气压下电离后直接进入质谱，巨大的优势就是快速.真空接口真空接口的作用离子从大气压进入真空，限制气体流速。尽可能的阻挡杂质进入真空系统，加载电压形成电场，流场使得尽可能多的离子进入真空系统。Orifice-Skimmer孔－锥结构Capillary毛细管结构.真空接口自由喷射膨胀形成簇离子：AnA+解决簇离子有几种方式：加热，加电压.离子传输离子传输的主要作用是在真空度一级一级下降的情况下，能够使得大部分离子通过，而中性原子分子被真空泵抽走，从而提高信号。常用两种：离子透镜和多极杆，其他的还有Ionfunnel（离子漏斗）.离子漏斗.离子传输器－离子透镜加载了电压的圆环或原片，其电场对离子有聚焦的效果，类似透镜。调节透镜电压会对信号有很明显的影响/science/article/pii/S1076567009016036/examples/einzel.html.离子传输器－多极杆当a=0(U=0)时，0<q<0.9的情况下，离子大部分都能够稳定通过。也就是说当只有交流电加载在四极杆时，在某个范围内的离子基本能够完全通过四极杆。六级杆，八极杆等有同样的效果.多极杆离子传输器q值有范围，也就意味着调节多极杆电压参数时，要注意范围并非越高越好，电压高了之后，可通过的离子范围下限会变高，从而使得低质量数离子通过率下降。m/zAC(V)

5.001.5245.7259.7518.21546.33114.5034.901046.93169.2551.581547.54224.0068.272048.15278.7584.962548.76333.50101.653049.36388.25118.333549.97443.00135.024050.58497.75151.714551.19552.50168.395051.79607.25185.085552.40662.00201.776053.01716.75218.456553.62771.50235.147054.22826.25251.837554.83881.00268.518055.44935.75285.208556.05990.50301.899056.661045.25318.589557.261100.00335.2610057.871154.75351.9510558.481209.50368.6411059.091264.25385.3211559.691319.00402.0112060.301373.75418.7012560.911428.5435.3813061.521483.25452.070794813562.121538468.75771614062.731592.75485.444637314563.341647.5502.131558615063.951702.25518.818479915564.551757535.505401216065.161811.75552.192322516565.771866.5568.879243817066.381921.25585.566165117566.981976602.253086418067.592030.75618.940007718568.20.多极杆的聚焦冷却效果.检测器.检测器常用的LCMS检测器为电子倍增管微弱的离子信号转化为电子信号，并被放大成电流信号FromW.电流信号的放大离子束电子倍增管电流电阻电压电压放大器模数转化器模拟模式（Analogmode）过程.计数模式Ioncountingmode（计数模式）.休息一下…..整机举例(LCMS-1000).质谱软件软件主要包括两部分：控制采集和数据处理。控制采集一般而言会包括：调谐校准，方法建立，采集序列，反馈，实时显示，报告等等.数据处理一般包括定性分析和定量分析.调谐校准.关于调谐校准一般建议用户一周调谐校准一次，或长时间停用后应该调谐校准一次对于初级用户或对仪器了解程度还比较浅的用户，推荐使用自动调谐对于高级用户，请确信您了解更改设置时对信号的影响在单四极杆LCMS中，调谐校准的标准一般是单位质量分辨率（在高质量数一端可适当放宽），高质量数的信号尽可能高，峰形高斯分布，质量数偏移量在±0.2amu以内等.方法.质谱方法设置全扫描（FullScan）和选择离子扫描（SIM）全扫描模式（FullScan）：扫全谱，谱图包含了整段的信号选择离子扫描（SIM）：扫某个或某几个质谱点，谱图仅包括几个孤立的点。.序列与实时窗口.数据处理提供多种对质谱谱图和峰的处理功能.数据处理色谱图LCMS色谱图就是TIC图，每谱图的总强度作为一个点形成色谱图。扣除背景信噪比自动积分手动积分峰拆分等等功能.谱图库搜索单四极杆型的LCMS常常使用ESI或APCI等软电离方式作为离子化方法。谱图比较简单个人观点：LCMS的谱图库搜索不一定比直接分析来得快….仪器性能判定质量数质量数越高，那么能够覆盖的范围越大,目前主流在1250－2000amu范围（天瑞目前1500amu，明年到2000amu）。并非一定越高越好！分辨率.分辨率计算方法.FromSummerCoursebyProfessorZhengOuyang并非越高越好！.灵敏度检出限10pg利血平，提取609.3amu的XIC图，不过色谱柱，S/N＝122.6目前主流仪器的检出限在100－300：1，天瑞公布的指标为50：1.扫描速度目前主流产品的扫描速度：最高10000－11000amu/s关于扫描速度：并非越高越高，高扫描速度的代价往往是数据失真。不推荐使用最高扫描速度。一般常规扫描速度1000amu/s已经足够使用。.应用举例（天瑞LCMS－1000应用）土霉素质谱条件：离子源：ESI(+)离子源温度：130℃电喷雾电压：4.8kV检测器电压：1.2kV打拿级电压：9.8kV.金霉素质谱条件：离子源：ESI(+)离子源温度：130℃电喷雾电压：4.8kV检测器电压：1.2kV打拿级电压：9.8kV.1.2安芬伪麻美芬片（白片）对乙酰氨基酚152.2盐酸伪麻黄碱166.3氢溴酸右美沙芬272.4质谱条件：离子源：ESI(+)离子源温度：130℃电喷雾电压：4.8kV检测器电压：1.2kV打拿级电压：9.8kV.1.2安芬伪麻美芬片（黑片）对乙酰氨基酚152.2盐酸伪麻黄碱166.3氢溴酸右美沙芬272.4盐酸苯海拉明256.3质谱条件：离子源：ESI(+)离子源温度：130℃电喷雾电压：4.8kV检测器电压：1.2kV打拿级电压：9.8kV.ACTH（4-11），human肽序：M-E-H-F-R-W-G-K分子量：1090.28质谱条件：离子源：ESI(+)