细菌和噬菌体的重组和连锁

第七章细菌与噬菌体的重组和连锁第一节细菌和病毒在遗传学研究中的地位第二节细菌的遗传分析第三节噬菌体的遗传分析第一节细菌和病毒在遗传学研究中的地位作为遗传学研究对象的细菌和病毒细菌和病毒是遗传学研究的好材料作为遗传学研究对象的细菌和病毒细菌1、大小：细胞较小，长约1-2μ，宽约0.5μ；2、结构：结构简单〔鞭毛、细胞壁、质膜、间体、核质体、核糖体等〕；2、遗传物质：单个主染色体，一个大型的环状核酸分子，称之为基因带。一个或多个小染色体〔质粒〕。3、涂布和繁殖：20分钟一代，一个细胞〔一夜〕107个子细胞，成为肉眼可见的菌落或克隆。4、生理特性突变〔1〕营养缺陷型：丧失合成某种营养物质能力，不能在根本培养基上生长。原养型：野生菌株那么可在根本培养基上生长。用不同的选择性培养基----测知突变的特性。〔2〕抗性突变型：如抗药性或抗感染性。例：青霉素抗性突变的菌落。测定突变的方法------影印平板法：黎德伯格等〔LederbergJ.andLederbergE.M.,1952〕设计。病毒：不是细胞，是比细胞更单纯的一种生命形式，不能单独生长和增殖。病毒结构：蛋白质外壳+包被在内的核酸。按寄主分类：动物病毒、植物病毒、细菌病毒〔噬菌体〕等。遗传物质：单倍体，只有一条染色体，单一的核酸分子〔基因带〕。DNA或RNA。1、细菌能合成全部氨基酸和维生素。能在一定的培养基上生长，不难找出各个营养缺陷型所需的营养物质，有利于从生化角度来研究基因的作用。2、世代周期短，繁殖迅速，代谢旺盛，便于基因的作用研究。例大肠杆菌(E.coli)20分钟可繁殖一代。3、便于研究基因突变。虽然突变率很低，但所观察的性状为抗营养缺陷型突变，那么不难检出。4、便于基因重组研究。细菌具有转化、转导和接合等作用，利用这些特性可以进行精密的遗传学分析。5、个体小，体制简单，便于管理和生化分析，也易于进行基因工程的操作。细菌和病毒是遗传学研究的好材料第二节细菌的遗传分析细菌的杂交F因子高频重组用中断杂交技术作连锁图大肠杆菌的染色体呈环形F因子整合到细菌染色体的过程细菌的交换过程重组作图性导三种不同的致育因子的相互关系转化〔transformation〕概念：指某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程1928年，阿委瑞〔AveryO.T.〕在肺炎双球菌中发现转化现象。1944年，格里费斯〔GriffithF.〕成功地进行了肺炎双球菌转化试验，证实遗传物质是DNA，转化是细菌交换基因的方法之一。转化条件：细菌要活泼地摄取外源DNA分子，那么必须具备重组程序所必需的酶。转化三种细菌：肺炎双球菌、枯草杆菌、流感嗜血杆菌都可用作转化细菌。转化的两个例子：〔1〕用2个带有不同抗性的肺炎双球菌群体混合时，可发现带有双抗性的细菌。细菌裂解---DNA残留---其他细菌摄取转化。〔2〕枯草杆菌活细胞外表能分泌DNA，可被其他细胞摄取。1、供体和受体的互作〔1〕转化片段的大小肺炎双球菌转化：DNA片段至少有800个碱基对；枯草杆菌转化：DNA片段至少有16000个碱基对；〔2〕供体DNA分子存在的数目。对特定基因来说，供体DNA分子数目与成功转化有关。〔3〕受体的生理状态感受态是指细胞处于刚刚停止DNA合成，而蛋白质合成继续活泼进行时的状态。活泼合成的蛋白质可使细胞膜易于接受转化DNA。只有感受态受体细胞才能摄取并转化外源DNA，而这种感受态只能发生在细胞生长周期的某一阶段。2、转化DNA的摄取和整合过程〔1〕结合和穿入。〔2〕联会。按各个位点与其相应的受体DNA片段联会。亲缘关系越远，联会越少，转化的可能性越小。〔3〕整合〔重组〕。指单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地参入到受体DNA中。它对同源DNA有特异性，异同源DNA视亲缘关系远近，也可发生不同频率的整合。营养缺陷型：丧失合成某种营养物质能力，不能在根本培养基上生长。原养型：野生菌株那么可在根本培养基上生长。抗性突变型：如抗药性或抗感染性。1按不能合成的物质来命名，取前3个字母，右上角“-〞----缺陷型；“+〞---野生型。例：bio-生物素缺陷型；bio+生物素野生型2对抗生素敏感或抗性品系，也取前3个字母，右上角“s〞(sensitive)----敏感型；“r〞(resistant)---抗性。例：strs链霉素敏感型；strr链霉素抗性细菌杂交黎德伯格(Lederberg)和塔特姆(Tatum)实验〔1946年〕不同营养缺陷型的大肠杆菌：菌株AMet-bio-thr+leu+thi+需加甲硫氨酸和生物素。菌株BMet+bio+thr-leu-thi-需加苏氨酸和亮氨酸和硫胺。菌株A和菌株B都为营养缺陷型，不能在根本培养上生长。A+B菌株在含有以上5种物质的培养基上混合培养，几小时后离心，涂布在根本培养上，长出菌落。而频率为107个细胞中有一个。〔用果蝇做材料很难做到这一点〕黎德伯格Lederberg,塔特姆Tatum

1946年P214图7-1这一结果如何出现的呢？是一些物质从一个菌株的细胞中泄漏出来而为另一菌株的细胞所吸收？还是细菌发生了杂交？U型管实验：把A、B菌株分别培养在在两臂上→中间的滤过器可使培养液通过，但细菌不能通过→结果任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌。P215图实验结果说明：直接接触〔接合〕是原养型细出现的必要条件。上述2个实验说明菌株A和菌株B发生了杂交，产生了与两个亲代菌株不同的野生型：Met+bio+thr+leu+thi+接合〔conjugation〕是指原核生物的遗传物质从供体〔donor〕转移到受体〔receptor〕内的过程。特点：需要通过细胞的直接接触。接合过程是一种单项转移：A菌株遗传物质→B菌株，从供体转向受体。F因子(Ffactor或Felement〕例Hayes大肠杆菌实验〔P216〕菌株A×菌株BMet-thr+leu+thi+Met+thr-leu-thi-用链霉素处理菌株A或菌株B，但这种处理不杀死它们，只是阻碍它们的分裂。结果：处理过的菌株B×未处理的菌株A-----在培养基上无活下来。处理过的菌株A×未处理的菌株B----在培养基上有活下来，且频率跟未经处理的对照组一样。Hayes大肠杆菌实验解释大肠杆菌中遗传物质的交换不是交互的。菌株B为受体，菌株A是供体(有F因子)，供体经链霉素处理后不能分裂，但仍能转移基因〔F因子〕，而受体未被处理，当然仍能分裂，所以，接受转移过来的基因〔F因子〕后，可在培养基上形成菌落。所以，处理过的菌株B×未处理的菌株A-----在培养基上无活下来。处理过的菌株A×未处理的菌株B----在培养基上有活下来，且频率跟未经处理的对照组一样F因子〔致育因子；性因子〕:是染色体以外的遗传物质，是一种附加体，具有赋予中性细菌以性别的性质。携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F+表示；未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F-表示。F因子的组成：一种封闭的环状DNA分子，相对分子质量约为3.5*106。40~60个蛋白质基因；2~4个/细胞〔雄性〕。F因子的三种状态〔以大肠杆菌为例〕：〔1〕一个有自主的F因子，用F+表示；〔2〕没有F因子，用F-表示；〔3〕一个整合到自己染色体内的F因子，用Hfr表示。

细菌由分裂而增值时，F+细菌--F+细菌、F-细菌--F-细菌，但混合培养时，F-细菌转变为F+细菌。因为F因子通过性伞毛从F+细菌转移到F-细菌，但F+细菌仍能自我复制，所以，混合培养液中，几乎全为F+细菌。但染色体很少通过结合而转移到F-细菌，所以染色体上基因的重组频率是很低的，不到万分之一。假设要把F+细菌的F因子丧失，成为F-细菌。最有效的方法是用吖黄素处理。调节丫黄素浓度，可不防碍细菌增殖，但可选择性阻碍F因子复制。菌株A中的一种新菌株，跟菌株B〔F-〕杂交时，出现重组子的频率很高，几乎比F+×F-杂交〔重组率约约10-6〕高一千倍。在菌株杂交时，出现很高频率的重组子，这个菌株叫高频重组(highfrequencyofrecombination)菌株，简称Hfr菌株。整合在Hfr染色体上的F因子又可脱离染色体而恢复游离状态〔这种F因子叫做F'因子〕上面谈到，F+×F-杂交中，几乎所有F-转变为F+，而在Hfr×F-杂交中，尽管出现高频的重组，但F-细菌很少有转变为的F+细菌的高频重组用中断杂交技术作连锁图20世纪50年代，沃尔曼〔Wollman〕和雅科〔Jacob〕中断杂交试验，其目的是：Hfr细菌在交配中，什么时候把基因转移给F-细菌的。结果发现接合时的遗传物质转移是直线进行的。Wollman和Jacob实验Hfrthr+leu+azjrtonrlac+gal+strs×

F-thr-leu-azjstonslac-gal-strr〔P219表7-1〕Hfr细菌+F-细菌混合培养—隔一段时间取样—搅拌—稀释〔防止再度配对〕--涂布在含有链霉素〔str〕，但不含苏氨酸〔thr+〕亮氨酸〔leu+〕的培养基上。因为：Hfr细菌是strs，所以不能生长。而F-细菌是thr-leu-也不能生长。所以只有strrHfr细菌和thr+leu+F-细菌的重组子才能生长。然后利用中断杂交技术即可知道Hfr细菌是什么时候把thr+leu+转移给F-细菌的。这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图技术，称为中断杂交技术。Wollman和Jacob实验结果在两菌株混合后8分钟时，还未见有供体菌的非选择性标记基因进入F-细菌。9分钟时开始出现azi，然后相继出现其他抗性菌落。从Hfr菌株的基因在F-细菌中出现开始，随着时间的推移，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一百分数为止；而且某一基因出现的时间愈早，它所到达的百分数也愈高。例如：azi抗性基因出现最早，在24分钟时就到达约90%的F-菌落；gal基因出现最迟，即使在混合后60分钟时取样，也只有30%的菌落属于能利用型。总结1、重组体中各标记基因进入F-细胞中时间不同，到达最高水平的时间也不同。2、随时间的推迟，某个基因的重组率增加；一定程度后，重组率便不再增加。如：10分钟时，tonr首次出现，15分钟时40%，25分钟80%，所以，Hfr细菌的基因是按一定线性顺序依次地进入在F-细菌。3、以基因出现的时间为标准----作出大肠杆菌的遗传连锁图。4、用一种大肠杆菌的不同Hfr菌株进行中断杂交试验，作出连锁图，其基因向F-细菌转移的顺序不同。因为基因是在染色体上，也就是说Hfr细菌的基因的转移是从染色体的一端〔原点或O〕开始，以线性方式进入F-细胞中，基因离开原点愈远，进入F-细胞愈迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程停止以前，仍未转移，因而斜率较低，到达的顶峰值也较小。Wollman和Jacob发现F因子最后转移到受体，并使它们成为供体，但效率较低，是线性染色体的最后一个单位。OazitonlacgalF大肠杆菌的染色体呈环形由表7-3可见：而初看起来每个基因的转移似乎没有规律，但仔细分析可发现每个基因转移顺序是不变的，所以，Hfr细菌的基因顺序虽不相同，但不是随机的。它们的相对位置未变；从原点O开始，F因子总是最后转移，在原点的另一端。由上述事实，科学家提出假设：F+细菌中F因子能在细菌相互结合时，从F+细菌转移到F-细菌，使F-细菌成为F+细菌。如果F+雄性细菌的染色体是环状的，而且，还有一个F因子，那么，任何线性的Hfr染色体的形成都可用F因子插入环状染色体的不同地点来说明。F因子整合到细菌染色体的过程F因子的插入决定了Hfr的极性，F因子所在的地方是末端，另一端那么为原点，是染色体转移的起点。F因子的插入过程：环状的细菌染色体和环状的F因子的一个简单交换形成一个较大的环〔P225图7-7〕F因子细菌染色体Hfr染色体F因子整合到细菌染色体的过程质粒：指染色体外遗传因素，它可以自我复制，并在分裂时分配到子细胞中。〔F因子是质粒的一种〕

附加体：质粒中，有的除了可在染色体外自律地增殖以外，还可整合到染色体上，成为染色体的一局部，这样的质粒称为附加体。环形的F因子包括几局部：原点〔是转移的起点〕；形成伞毛的细胞群；DNA复制酶基因〔与F基因本身的复制有关〕；插入序列〔IS，与插入到细菌染色体的过程有关〕IS聚集在F因子的某个区域，另一方面在大肠杆菌染色体的各个区域也有多数IS存在。如两个IS配对，发生交换，F因子就整合到染色体上。IS有极性，所以交换后整合到细菌染色体的F方向也就随着定了。A：F因子以顺时针方向插入proB和lac之间。B：F因子以逆时针方向插入proB和lac之间。细菌的交换过程原核类中的遗传交换是在一完整的基因组〔F-内基因子〕与一不完整的基因组〔供体外基因子〕间进行的。F-染色体与Hfr染色体间发生单交换是没有用的，因为环断裂后，只产生不平衡的局部二倍体线性染色体〔P227图7-11〕。而F-染色体与Hfr染色体间发生偶数交换，才能产生有活性的重组子和片段〔P228图7-12〕。细菌重组的特点：1、只有偶数交换才能产生平衡的重组子。2、相反的重组子不出现，所以在选择培养上只出现一种重组子重组作图在中断杂交试验中，可以根据基因转移的先后次序，以时间为单位，得出基因的连锁关系。如果两基因间转移的时间单位接近2分钟，那么中断杂交技术测定基因间的正确图距就不很可靠。这时可用传统的重组作图法。时间单位和重组值的关系大致是1分钟=20%重组值性导〔sexduction〕F’因子：1959年Adelberg在大肠杆菌中发现一种新的F因子。正常的Hfr菌株只有在有性接合之末，才把性因子转移进去；而有一个Hfr菌株它的性因子转移频率似乎跟F+菌株一样高。这种新F因子转移到F-细胞后，使F-细胞变为F+细胞。Adelberg称这种新的F因子为F’因子〔带有局部细菌染色体的F因子〕性导〔sexduction〕：指接合时由F’因子所携带的外源DNA整合到细菌染色体过程。三种不同的致育因子的相互关系1、F’是带有局部细菌染色体的F因子，它的性质在F因子和Hfr之间。2、F’因子连同它所带有的局部细菌染色体可一起转移到F-细胞，其速率近于F因子。3、有F因子的细胞是F+细胞，没有F因子的细胞是F-细胞，每一细菌染色体有1-3个F因子。F+×F-杂交时，F因子进入F-细胞，使F-细胞变为F+细胞，而供体仍为F+细胞，其染色体很少转移。F因子可通过简单交换整合到细菌染色体上，形成Hfr染色体。相反，又可从Hfr产生F因子。4、Hfr能以高频率把细菌染色体转移到F-细菌中，而F因子因位于Hfr染色体的最末端，极少进入。F’因子和F因子很容易转移到F-细胞中，但供体染色体的转移率很低。第三节噬菌体的遗传分析烈性噬菌体噬菌体的基因重组溶源性的遗传根底转导遗传学规律的普遍性噬菌体感染细菌的病毒称为噬菌体。其结构简单〔蛋白质外壳、核酸、某些碳水化合物、